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第一部分　基本知识1

第一章　光的基本知识3

一、光的本质3

二、光的性质3

三、光的吸收5

第二章　荧光的基本知识6

第一节 荧光的发光原理6

一、荧光6

二、荧光的发光原理7

三、荧光色素及其大分子结构8

第二节 荧光色素的性质9

一、激发光波长和发射光波长9

二、激发光谱和发射光谱10

三、荧光强度12

四、荧光寿命12

五、荧光稳定性13

六、荧光色素分子间的相互作用13

七、荧光色素分子对环境的敏感性14

八、荧光色素的分类14

第三节 组织细胞的自发荧光与继发荧光15

一、组织细胞的自发荧光15

二、组织细胞的继发荧光17

第四节 荧光的淬灭及抗淬灭18

一、荧光的淬灭18

二、荧光的抗淬灭19

三、其他抗荧光淬灭方法22

第五节 荧光光谱交叉干扰及消除22

第三章　荧光染料（色素）的早期应用和发展史26

一、染料的早期应用和发展26

二、荧光染料（色素）的早期应用和发展27

三、荧光染料（探针）在活细胞中的早期应用和发展28

四、荧光染料（探针）在植物研究中的早期应用和发展29

第四章　常用的荧光染料（探针）32

第一节 细胞器荧光探针32

一、线粒体荧光探针32

二、溶酶体荧光探针34

三、内质网荧光探针34

四、高尔基复合体荧光探针36

第二节 细胞骨架荧光探针37

一、F-肌动蛋白荧光探针37

二、G-肌动蛋白荧光探针39

三、微管蛋白荧光探针39

四、微管选择性的紫杉醇探针40

第三节 研究钙调节及活性的荧光探针41

一、钙调蛋白荧光探针41

二、蛋白激酶C的荧光探针41

三、钙离子的荧光探针42

第四节 核酸荧光探针44

一、透性核酸荧光探针44

二、非细胞透性核酸荧光探针48

第五节 其他荧光探针52

一、D1和D5多巴胺受体荧光探针52

二、表皮生长因子受体（EGF）荧光探针52

三、甘氨酸受体荧光探针53

四、组织胺受体探针53

第五章　活体荧光材料——绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物57

一、发现绿色荧光蛋白57

二、绿色荧光蛋白的结构57

三、绿色荧光蛋白的特性及优点59

四、荧光蛋白的新进展61

第六章　最新型荧光材料——量子点64

一、量子点的定义及物理特性64

二、量子点具有优良的光学特性66

三、量子点的优点66

四、量子点技术在生物领域中的应用66

五、量子点技术的安全性69

六、量子点技术的发展前景70

第二部分　荧光色素（探针）在细胞生物学中的应用71

第七章　荧光技术在细胞凋亡研究中的应用73

第一节 细胞凋亡及其基本通路74

一、细胞凋亡74

二、细胞凋亡的基本转导通路75

第二节 荧光显微镜对细胞凋亡的形态学观察78

一、通过光学显微镜对凋亡细胞的形态学的观察78

二、通过电子显微镜对凋亡细胞的形态学的观察78

三、通过荧光显微镜对凋亡细胞的形态学的观察79

四、通过某些特定分子在细胞凋亡时定位的变化对其进行荧光标记80

第三节 凋亡调控分子的荧光标记在细胞凋亡研究中的应用80

一、荧光显微镜在对Survivin及其剪接体参与的细胞凋亡研究中的应用81

二、荧光显微镜在促凋亡蛋白RIP3核质穿梭性鉴定中的应用85

第四节 其他荧光技术在细胞凋亡研究中的应用87

一、Caspase活性的荧光检测87

二、蛋白表达调控元件活性的萤光检测89

第八章　流式细胞术在细胞生物学中的应用94

第一节 检测细胞的特征94

一、表型的分析94

二、胞内蛋白的检测96

第二节 检测细胞的增殖和凋亡状态101

一、用PI染色法分析细胞的增殖和凋亡101

二、检测细胞凋亡PI和Annexin-Ⅴ103

第三节 定量检测可溶性蛋白质（CBA技术）105

第四节 纯化特定的细胞109

一、原理109

二、方法109

三、预期结果109

四、注意事项110

第九章　荧光在细胞骨架研究中的应用111

第一节 荧光技术在微丝骨架研究中的应用112

一、概述112

二、胃壁细胞酸分泌过程中的微丝骨架蛋白研究113

三、材料与方法120

第二节 荧光技术在微管骨架研究中的应用121

一、概述121

二、有丝分裂过程中微管形态与功能的研究123

三、观察Hela细胞中微管和ACA蛋白的定位131

第十章　荧光原位杂交132

第一节 荧光原位杂交的基本原理与基本过程132

一、荧光原位杂交的基本原理132

二、荧光原位杂交的基本实验过程132

三、FISH技术新进展143

第二节 荧光原位杂交的应用145

一、基因定位145

二、染色体物理图谱构建146

三、染色体结构分析147

四、染色体数目测定148

五、研究染色体进化／比较基因组学148

六、转基因的细胞学鉴定149

七、基因表达分析和临床病毒学检测149

第十一章　荧光在HER2/ErbB2/p185研究中的应用150

第一节 用免疫荧光细胞化学的方法鉴定抗体与p185的结合特异性151

一、材料与方法151

二、结果152

第二节 EGFP在ErbB2胞内区核定位信号研究中的应用152

一、材料153

二、方法154

三、结果157

第十二章　绿色荧光蛋白（GFP）在细胞分子生物学中的应用162

第一节 绿色荧光蛋白（GFP）在动物细胞分子生物学中的应用162

一、探测细胞的流程162

二、确定细胞器的定位163

三、研究细胞骨架163

四、作为基因表达和细胞谱系的标记163

五、研究蛋白质之间的相互作用和构象变化164

六、研究细胞内信号传导164

七、亚细胞动力学研究164

八、研究细胞凋亡165

九、检测细菌165

十、转基因动物165

第二节 绿色荧光蛋白（GFP）在植物细胞和分子生物学中的应用166

一、植物细胞骨架研究166

二、细胞器动力学和内膜运输167

三、大分子运输和病毒在植物体内的运动168

四、植物与微生物之间的相互作用169

五、会发荧光的植物“哨兵”169

六、GFP在植物分子生物学研究中的应用169

第十三章　免疫荧光细胞化学技术172

第一节 免疫学基础知识172

一、抗原、抗体的概念及抗原和抗体的关系173

二、抗原的性质及种类173

三、抗体的性质和种类175

四、抗原与抗体的反应176

第二节 免疫荧光细胞化学的原理176

一、直接法177

二、间接法177

三、双重免疫荧光标记法178

四、对照试验178

第三节 荧光抗体的制备179

一、FITC标记抗体的方法179

二、荧光抗体的保存181

第四节 免疫荧光组织化学细胞和组织标本的制备181

一、组织标本的取材181

二、细胞和组织的固定182

三、组织切片185

四、玻片处理和涂胶187

第五节 免疫荧光细胞化学染色方法188

一、标本制作188

二、荧光抗体染色方法188

第六节 非特异性染色的消除方法191

一、非特异性染色的主要因素191

二、除非特异性染色的方法191

第三部分　常用荧光检测仪器195

第十四章　生物荧光显微镜197

第一节 普通生物光学显微镜197

一、显微镜的构造198

二、显微镜的成像原理200

三、显微镜的性能201

四、显微镜的操作及注意事项203

五、相差显微镜204

六、微分干涉差显微镜205

七、暗视野显微镜206

第二节 生物荧光显微镜206

一、荧光显微镜的分类及主要组成部分208

二、荧光显微镜落射式照明原理210

三、荧光显微镜的基本操作及注意事项211

第三节 细胞遗传工作站213

一、细胞遗传工作站的组成213

二、细胞遗传工作站的应用214

三、细胞遗传工作站的工作原理214

四、基本操作214

第十五章　激光扫描共聚焦显微镜222

第一节 基本原理223

第二节 主要部件224

一、激光器225

二、扫描器226

三、荧光显微镜227

四、计算机227

第三节 操作步骤及注意事项228

一、样品制备228

二、基本观察步骤及仪器操作229

三、获取3D图像230

四、获取时间序列图像230

第四节 主要用途231

一、细胞物理和生物化学测定231

二、激光扫描共聚焦图像分析及三维重组分析生物结构231

三、动态荧光测定231

四、荧光光漂白恢复——活细胞的动力学参数232

五、胞间通讯研究232

六、检测荧光共振能量转移232

七、细胞膜流动性测定232

八、笼锁-解笼锁测定233

九、粘附细胞分选233

十、细胞激光显微外科及光陷阱技术233

十一、生物芯片（biochip）233

第五节　LSM 510 META234

一、LSM 510 META的扫描模件234

二、LSM 510 META的优点234

三、LSM 510 META的操作过程236

第六节 其他用途236

一、FRAP/FLIP236

二、FRET237

第七节 应用于激光共聚焦的新技术239

一、TIRFM239

二、多扫描模块系统241

三、弧光灯光源的圆盘扫描系统241

第八节 双光子（多光子）激光扫描显微镜242

一、单光子激光扫描共聚焦显微镜的局限242

二、双光子（多光子）激光理论基础242

三、双光子（多光子）激光成像原理243

四、双光子共聚焦显微镜的优点243

第九节 注意事项及维护保养244

第十六章　活细胞显微成像技术245

第一节 活细胞荧光工作站245

一、荧光激发和显微成像系统246

二、图像信号采集系统249

三、环境控制系统249

四、光损伤控制系统250

五、计算机控制和信号处理系统250

第二节 其他活细胞显微成像技术251

一、全内反射显微镜技术251

二、荧光相关光谱技术253

三、荧光共振能量转移技术253

第十七章　活体体内荧光成像技术255

一、基本原理255

二、基本组成256

三、实验过程257

四、系统特性258

五、应用261

六、发展前景263

第十八章　流式细胞仪264

第一节 概述264

第二节 工作原理与基本构成266

一、工作原理266

二、基本构成266

第三节 主要用途270

一、细胞周期和DNA倍体分析270

二、细胞凋亡与坏死的检测270

三、染色体分析271

四、细胞表面标志的检测271

五、淋巴细胞亚群分析271

六、胞内蛋白的检测271

七、细胞的分选272

第四节 检测样品的制备272

一、直接标记细胞表面分子272

二、检测细胞内信号分子272

三、用PI单染检测细胞周期273

四、样品制备的注意事项273

第五节 仪器的基本操作步骤273

一、FAcs Calibur273

二、FAcs Aria274

第六节 重要参数及意义275

一、前向散射光（FSC）275

二、侧向散射光（SSC）276

三、荧光信号276

四、补偿值277

五、使用双色补偿质控样本，微调补偿278

第七节　数据处理与分析278

一、流式的实验数据主要有以下几种形式278

二、数据分析280

第十九章　荧光定量PCR仪281

第一节 概述281

第二节 基本原理282

一、荧光定量化学原理282

二、荧光定量PCR仪的光学原理284

三、荧光定量原理285

第三节 仪器介绍286

第四节 样品制备及操作步骤289

一、DNA用量289

二、TaqMan探针法PCR289

三、SYBR Green I荧光染料法PCR290

四、ABI Prism7000 SDS v1.0软件操作290

第二十章　荧光分光光度计292

一、基本结构与原理292

二、AMINCO-Bowman扫描荧光分光光度计293

三、基本操作296

第二十一章　激光扫描成像仪298

一、系统硬件组成及功能298

二、工作原理及操作步骤298

三、仪器参数299

四、荧光样品的制备299

附录　免疫细胞化学常用试剂及其配制方法301

第一节 缓冲液301

一、0.2mol/L（pH 7.4）磷酸缓冲液（phosphate buffer,PB）301

二、0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffered saline,PBS）302

三、Karasson-Schwlt磷酸盐缓冲液302

四、0.5mol/L(pH 7.6)Tris-HCl缓冲液303

五、Tris缓冲生理盐水（Tris buffered saline,TBS）303

六、Tris-TBS(PBS)303

七、0.1mol/L（pH 7.4）二甲胂酸钠缓冲液304

八、几种常用的不同pH值缓冲液的配制表304

第二节 固定剂306

一、4％多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.3）306

二、4％多聚甲醛-磷酸二氢钠／氢氧化钠306

三、Bouin液及改良Bouin液307

四、Zamboni（stefanini）液307

五、PLP液（periodate-lysine-paraformaldehyde fixative过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）307

六、Karnovsky液（pH 7.3）308

七、0.4％对苯醌（parabenzoquinone）308

八、PFG液（parabenzoqulinone-formaldehyde-gutaraldehyde fixative）309

九、碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液309

第三节 粘附剂310

一、铬矾明胶液310

二、甲醛-明胶液310

三、多聚赖氨酸（poly-l-lysine,PLL）311

四、Vectabond试剂311

第四节 封固剂311

一、甘油-TBS及甘油-PBS311

二、甘油-明胶（冻）312

三、液体石蜡312

四、DPX312

五、抗荧光淬灭剂312

第五节 其他辅助试剂312

一、蔗糖溶液312

二、Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）313

三、甲醇-H2O2液314

参考文献315