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1 引言1

1.1　细胞培养及肺癌发生1

第1章 培养中的人肺肿瘤细胞的生长1

1.2　肺癌细胞生长所需的生长因子和激素2

2　培养基及试剂的配制4

2.1 HITES基础培养基的配制5

2.2　C培养基和C改良培养基的配制6

3　安全提示7

4　操作步骤7

4.1　取材及运送7

方案1.1　肺肿瘤标本的处理7

4.2　细胞分离7

方案1.2　机械研磨法从肺肿瘤组织收集细胞8

方案1.3　用胶原酶解离肺肿瘤组织8

方案1.4　SCLC细胞的培养9

4.3　细胞培养的条件9

方案1.5　来源于腺癌和大细胞癌的肿瘤细胞的培养10

方案1.6　肺癌细胞的克隆化培养11

4.4　致瘤性及分化功能的分析12

4.5　其他方法12

5　讨论13

致谢14

材料来源14

参考文献15

第2章 正常及恶性胃上皮的培养17

1 引言17

1.1 胃癌17

1.2　正常胃上皮18

3　胃癌细胞的原代培养19

2.3　肿瘤标本的预处理19

3.1　实体瘤的培养程序19

2　胃癌组织原代培养的准备19

2.2　起始培养基19

2.1　生长培养基19

方案2.1　实体胃癌细胞原代培养的准备20

3.2　腹水培养程序21

方案2.2　密度梯度离心从腹水中分离胃癌细胞21

4　癌细胞的富集21

4.1　悬浮细胞团22

方案2.3　移出细胞团，富集癌细胞22

4.2　黏附性集落22

方案2.4　用机械法使细胞聚集体脱壁富集胃癌细胞22

方案2.5　刮除法富集胃癌细胞23

5　癌来源细胞的扩增和保存24

方案2.6　分步消化法富集胃癌细胞24

5.1　漂浮细胞聚集体25

5.2 紧密聚集的细胞团25

方案2.7　分散细胞聚集体，传代培养胃癌细胞25

5.3　贴壁细胞26

方案2.8　贴壁胃癌细胞的传代培养27

5.4　含有贴壁细胞和悬浮细胞亚群的培养物27

方案2.9　混合有悬浮胃癌细胞亚群和贴壁胃癌细胞亚群的传代培养27

6　培养的胃癌细胞系的代表性特征28

7　国际细胞库中的胃癌细胞系30

8　正常胃上皮细胞30

8.1　设备、试剂、培养基制备30

8.2　组织的获取及安全34

方案2.10　用胶原酶消化和Percoll分离细胞的方法原代培养人胃黏膜上皮细胞35

8.3　人体胃黏膜细胞分离和培养35

方案2.11 利用胶原酶／离散蛋白酶消化，在胶原上接种原代培养人胃黏膜上皮细胞36

方案2.12 利用胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶原代培养胃黏膜上皮细胞37

8.4 人胚胎胃细胞的分离和培养39

方案2.13　人胚胎胃细胞的培养39

8.5　人胃窦细胞的分离和培养39

方案2.14　人胃窦细胞的分离和培养39

8.6 胃黏膜细胞培养物的鉴定41

方案2.15　体外胃上皮细胞生长测定41

方案2.16 PAS细胞化学鉴定黏蛋白42

方案2.17 胃细胞黏液的免疫组织化学42

方案2.18　通过细胞角蛋白染色确认胃细胞43

方案2.19 用抗胃蛋白酶-Ⅱ和胃H+/K+-ATP酶免疫荧光鉴定胃细胞类型43

方案2.20 胃上皮培养物的光镜观察44

方案2.21 胃上皮培养物的电镜观察45

8.7　正常胃上皮培养物的主要应用46

致谢46

材料来源47

参考文献48

第3章 结肠癌细胞系的建立51

1 引言51

2　培养基及试剂的配制52

2.1　培养基52

2.2 消化酶53

2.3 消毒液53

2.4　包被胶原54

方案3.1　包被Ⅰ型胶原用于结肠癌细胞的培养54

3　用肿瘤活检标本建立细胞系54

方案3.2　结肠癌肿瘤组织的原代培养55

3.1　原代培养55

3.2　传代培养56

3.3　细胞的冷冻保存56

3.4　特性鉴定57

4　取材自腹水的细胞培养58

方案3.3　来自腹水的结肠癌细胞的培养58

5　其他方法58

5.1　饲养层细胞58

5.2　异种移植59

5.3　取材自遗传综合征患者的结肠癌细胞的培养59

6　供应商59

6.1　培养用塑料器皿59

6.2　培养基59

材料来源59

参考文献60

第4章 胰腺癌来源的培养细胞：基因改变的研究及在实验性胰腺癌转移模型中的应用63

1 引言63

2　细胞系的建立64

2.1　肿瘤组织的来源64

2.2　原代培养64

方案4.1　胰腺肿瘤组织的原代培养64

方案4.2　来源于腹水的胰腺肿瘤细胞的原代培养66

3　肝转移实验67

方案4.3　裸鼠异种移植肿瘤转移实验67

3.1　肿瘤转移分析结果68

4　人胰腺癌原位移植模型69

4.1　手术过程69

方案4.4　胰腺癌细胞系的原位移植69

4.2　裸鼠胰腺癌细胞原位移植后的自然病程69

4.4　移植肿瘤的显微观察70

4.3　移植肿瘤的肉眼观察70

5　基因改变71

5.1　Ki-ras基因突变（密码子12）71

5.2　p53基因突变71

5.3　CDKN2 A基因的改变71

5.4　基因研究的结果72

材料来源73

参考文献74

第5章　体外膀胱癌培养的建立和鉴定75

1 引言75

1.1 背景75

1.2　病理学75

1.3　方法原理76

2.1　培养基和盐溶液77

2　培养基和试剂的准备77

2.2　胶原包被培养板78

方案5.1　从鼠尾提取胶原78

方案5.2　氨重建胶原凝胶底物79

3　安全提示80

4　培养80

4.1　组织的获取80

4.2　原代培养80

方案5.3　膀胱肿瘤原代培养80

4.3　TCC的传代培养81

方案5.4　原代培养膀胱肿瘤的传代培养81

4.4　细胞的冷冻和复苏82

5　转化状态建立的标准82

6.1　细菌和真菌污染83

6　常见问题的处理83

6.2　成纤维细胞污染／生长羸弱84

6.3　分化84

7　方法应用85

8　其他方法学87

8.1　胶原酶消化87

方案5.5　胶原酶消化膀胱肿瘤87

8.2　单细胞悬浮培养和其他培养技术88

8.3　其他要求88

9　可供使用的持续性细胞系目录88

致谢91

材料来源91

参考文献91

1 引言97

第6章 正常及恶变人前列腺上皮细胞的长期培养97

2　制备培养基99

3　获取组织100

4　处理组织100

5　原代细胞培养的建立101

方案6.1　正常、良性及恶性前列腺的原代培养101

6　原代培养的维持102

7　原代细胞培养的永生化103

方案6.2　前列腺上皮细胞培养的永生化104

7.1　安全提示104

8　稳定细胞系的特性105

8.1　杂合缺失的检测105

方案6.3　前列腺细胞系杂合缺失的检测105

9　稳定细胞系的维持106

方案6.4　长期前列腺细胞系的维持106

方案6.5　永生化前列腺细胞系的冻存107

10　稳定细胞系的冻存107

方案6.6　冻存前列腺细胞系的复苏108

11　应用108

致谢109

材料来源109

参考文献110

第7章 以实体瘤和腹水建立人卵巢上皮肿瘤细胞系113

1　引言113

1.1　胚胎学和组织学113

1.2　卵巢肿瘤的病理学和病因学115

1.3　卵巢癌的临床特征115

1.4　卵巢肿瘤细胞培养和细胞系建立的概述116

2.3　CMF117

2.5 胰蛋白酶／EDTA117

2.4　胰蛋白酶117

2.2 双倍浓度的Dulbecco's培养基2×DMEM117

2.1　培养基PPIGSS117

2　培养基和试剂的准备117

2.6　DNase118

2.7　CFA118

3　肿瘤的收集118

3.1　伦理许可118

3.2　收集体系118

3.3　从手术室收集实体瘤和腹水118

方案7.1 卵巢肿瘤样品的收集119

3.4　病理学报告剖析120

4　原代培养121

4.1　实体瘤的破碎121

方案7.2　卵巢肿瘤的机械破碎122

方案7.3　卵巢肿瘤的冷胰蛋白酶酶解破碎123

方案7.4　渗透压脉冲（快速吹吸裂解）去除血红细胞124

方案7.5　密度离心去除血红细胞124

4.2　去除血红细胞124

4.3　原代培养的起始125

方案7.6　卵巢肿瘤细胞的原代培养125

方案7.7　腹水来源的卵巢癌细胞培养126

5　原代培养的后续工作126

5.1　细胞分离127

方案7.8　用差别酶处理（DET）从混合细胞型黏附培养物中分离细胞127

5.2　与DET组合的无细胞腹水（CFA）的利用128

方案7.9　利用单层间皮细胞选择适合于上皮间质分离的腹水129

方案7.10　从CFA和DET的混合单层细胞中分离卵巢肿瘤细胞130

6　传代培养131

7　培养中的细胞鉴定133

参考文献136

材料来源136

第8章 宫颈癌癌细胞系的培养139

1　引言139

2　安全注意事项140

3　培养基及试剂的配制141

3.1　破碎试剂141

3.2　培养基141

3.3　台盼蓝142

3.4　琼脂克隆试剂142

4　短期培养的建立143

方案8.1　宫颈瘤细胞悬液的制备143

方案8.2　宫颈瘤细胞的软琼脂分析145

4.1　短期培养物的应用146

5　长期培养的建立146

方案8.3　3T3饲养细胞层的生成146

方案8.4　宫颈瘤原代培养的建立147

方案8.5　宫颈瘤细胞的传代培养148

5.1　冷藏149

5.2　建立长期细胞系的其他方法149

5.3　肿瘤细胞系的特征149

6　长期培养物的应用152

7　结论155

材料来源156

参考文献156

第9章 人类乳腺肿瘤细胞的原代培养159

1　引言159

1.1　乳腺癌模型：细胞系159

1.2　乳腺癌模型：原代培养细胞159

2.4　原代培养基160

2.6　Tris缓冲盐溶液（TBS）160

2.5　完全培养基160

2.2　器官样培养基（OM）160

2.3 收集培养基160

2.1　抗生素溶液（ABC-PBSA）160

2　培养基及试剂的配制160

3　乳腺肿瘤细胞的培养161

方案9.1　胶原酶分散乳腺肿瘤组织161

方案9.2 已解离的乳腺肿瘤细胞的培养162

4　鉴定163

4.1　培养物表型的确定163

方案9.3　免疫染色确定培养乳腺细胞的表型163

4.2　流式细胞分析165

方案9.4　乳腺细胞培养物的流式细胞分析165

4.3　生长控制165

5　乳腺癌细胞模型的应用167

参考文献168

致谢168

材料来源168

第10章 肌上皮细胞：培养和研究方法171

1　引言171

2　肌上皮细胞的研究172

3　肿瘤侵袭的抑制173

4　肿瘤血管发生的抑制181

5　生理学和药理学操作188

6　肌上皮细胞基因产物作为代理终点标记物188

7　转化的肌上皮细胞189

8.6　F12/DMEM/H190

8.10　尿素／盐酸胍提取缓冲液190

8.9　高盐缓冲液190

8.8　无血清F12/DMEM/H190

8.7　解离酶培养基190

8.4　破碎培养基190

8.5　胰蛋白酶-EDTA190

8.3　CMF-HBSS190

8.2　贴壁培养基190

8.1　补充的K-SFM190

8　培养基及试剂的配制190

8.11　Tris缓冲盐（TBS）191

9　转化的和正常的人肌上皮细胞培养191

9.1　转化的肌上皮细胞191

方案10.1　转化的人肌上皮细胞培养191

9.2 正常的肌上皮细胞192

方案10.2　正常的人肌上皮细胞培养193

9.3　复苏和特征描述194

方案10.3　人肌上皮细胞基质的制备196

10　肌上皮细胞基质的获取方法196

11　未来肌上皮细胞研究的方向198

材料来源199

参考文献199

第11章 多阶段头颈部鳞状上皮细胞癌201

1　引言201

2　培养基和试剂的制备202

2.1　生长培养基202

2.2　胰蛋白酶／EDTA203

2.3　经辐射过的3T3（X3T3）细胞饲养层的制备203

3　肿瘤样品的采集、分期和病理学203

4　来自SCC-HN和黏膜红斑的细胞培养物204

方案11.1　头颈部鳞状细胞癌的外植块培养204

方案11.2　SCC-HN细胞的传代培养205

方案11.3　黏膜红斑活检组织的冷胰蛋白酶消化法205

5.2　透射电镜206

方案11.4　单层角质形成细胞的透射电镜观察206

5　培养物的特征206

5.1　鉴定角质形成细胞206

5.3　角质形成细胞瘤、相应患者淋巴细胞和成纤维细胞的DNA指纹分析208

5.4　从正常、癌前和恶性鳞状上皮分离的角质形成细胞的增殖能力209

方案11.5　角质形成细胞在琼脂中的克隆生长209

5.5　癌前和恶性人类角质形成细胞缺乏对终末成熟信号的反应212

方案11.6　角质形成细胞终末成熟分析213

5.6　癌前和恶性人类角质形成细胞的致瘤性214

方案11.7　在裸鼠上的致瘤性214

5.7　细胞遗传学215

方案11.8　癌前和恶性人类角质形成细胞的染色体分析215

6　讨论和应用216

参考文献220

致谢220

材料来源220

第12章 正常、良性及恶性黑素细胞的培养225

1　引言225

1.1　单纯正常黑素细胞的培养225

1.2　痣、原发病变和晚期病变来源的黑素细胞231

1.3　黑素细胞起源的确定233

2　储存液及培养基的制备233

2.1　储存液233

2.2　培养基的配制235

2.3　组织准备236

方案12.1 正常人包皮的中性蛋白酶消化236

方案12.2　人包皮的胰蛋白酶消化237

方案12.3　来源于痣及原发黑素瘤的黑素细胞培养238

方案12.6 黑素细胞维持培养239

方案12.4　来源于晚期病变的黑素细胞培养239

方案12.5　新霉素（Geneticin,G418）处理去除成纤维细胞239

2.4　培养方法的变化240

3　安全提示240

4　主要应用241

4.1　基因变异241

4.2　信号转导和自主生长241

4.3　恶性肿瘤进展的体内和体外模型241

4.4　黑素瘤疫苗242

4.5　移植242

致谢242

材料来源242

参考文献243

1.1　背景251

第13章 人类白血病-淋巴瘤细胞系的建立和培养251

1 引言251

1.2　方法学原理252

2　培养基及试剂的配制254

2.1　培养基254

2.2　条件培养基254

方案13.1　用5637细胞制备条件培养基255

3　细胞系的建立255

3.1　获得细胞255

方案13.2　收集样本用于培养白血病／淋巴瘤细胞256

3.2　分离细胞256

方案13.3　密度梯度离心法分离单个核细胞256

3.3　细胞计数257

3.4　培养条件257

方案13.4　从白血病／淋巴瘤建立连续细胞系258

方案13.5　白血病／淋巴瘤细胞和细胞系的细胞学259

3.5　早期种系细胞的保存259

3.6　细胞形态学259

4　细胞系的冷冻和储存260

4.1　细胞的冷冻260

方案13.6 白血病／淋巴瘤细胞系的冷冻保存260

4.2　储存于液相或气相261

5　细胞系的解冻、扩增和维持261

5.1　细胞的解冻261

方案13.7　冻存白血病／淋巴瘤细胞系的解冻261

5.2　细胞的扩增262

方案13.8 白血病／淋巴瘤细胞系的扩增262

5.3　细胞系的维持263

6　细胞系鉴定和公布263

6.1　新细胞系的基本要求263

6.2　细胞系的鉴定265

6.3　细胞系的分类267

7　生物安全性268

8　评述269

8.1　一般情况下要考虑的因素269

8.2　培养环境269

8.3　细胞培养的常见问题270

8.4　时间上的考虑270

材料来源271

参考文献272

第14章 恶性脑肿瘤的体外培养275

1 引言275

1.1　恶性脑肿瘤的发病率、组织学和预后275

1.2　恶性脑肿瘤的细胞培养276

2.2　培养基和血清278

2.1　活检组织的采集和处理278

2　培养基及试剂的配制278

2.3　酶279

2.4　其他试剂279

3　短期培养的方法279

3.1　胶原酶分解取材的单层细胞培养279

方案14.1　胶原酶分解与脑肿瘤的原代培养280

3.2　其他分解离散方法281

3.3　小的外科手术活检组织的移植培养281

方案14.2　脑肿瘤的原代移植培养281

3.4　其他移植物培养方法281

3.5　换液、传代和污染试验282

方案14.3 源于原代培养的脑肿瘤细胞的传代282

方案14.4　脑肿瘤培养物的支原体筛查284

方案14.6　脑肿瘤培养物的细胞浆抗原的免疫染色方法285

4.1　细胞浆抗原的染色285

方案14.5　脑肿瘤培养物的冷冻保存285

4　脑肿瘤培养物抗原表型的测定285

4.2　细胞核抗原的染色286

方案14.7　脑肿瘤培养物的细胞核抗原的免疫染色方法286

4.3　细胞表面抗原的染色287

方案14.8　脑肿瘤培养物的细胞表面抗原的免疫染色方法287

5　安全提示288

致谢289

材料来源289

参考文献290

第15章 人神经内分泌肿瘤细胞的培养293

1 引言293

2.3　D-多聚赖氨酸包被培养容器294

2.2　从成纤维细胞中分离肿瘤细胞的胶原酶培养基294

2.1　转运培养基294

2　试剂和材料294

2.4　生长培养基295

2.5　用于细胞遗传学分析的生长培养基295

2.6　无血清的培养基（改进Brower等人的技术）295

3　肿瘤标本的收集和冻存295

3.1　肿瘤标本的收集296

方案15.1　神经内分泌肿瘤标本的收集296

3.2　活检标本的冷冻296

方案15.2　神经内分泌肿瘤活检标本的冻存296

4　原代培养297

方案15.3　神经内分泌肿瘤标本的原代外植块培养297

方案15.4　机械分散神经内分泌肿瘤标本的原代培养298

5　长期培养和连续细胞系299

方案15.7　培养的神经内分泌细胞的低温储藏300

6　培养细胞的低温储藏300

方案15.5　非贴壁细胞系传代培养300

方案15.6　去除神经内分泌培养物中的成纤维细胞300

7　特性鉴定301

7.1　免疫细胞化学301

方案15.8　培养的神经内分泌细胞的免疫细胞化学301

7.2　电子显微镜术303

方案15.9　神经内分泌培养物的透射电子显微术304

方案15.10　神经内分泌培养物的扫描电子显微术305

7.3　细胞遗传学分析306

方案15.11　贴壁的和悬浮的神经内分泌细胞的染色体分析307

7.4 MTC细胞系的致瘤性检测307

方案15.12　神经内分泌肿瘤细胞在裸鼠体内的致瘤性307

8.2　特性308

8.1　建立细胞系308

8　结果和应用308

8.3　抗癌药物筛选311

8.4　凋亡311

8.5　治疗312

9　细胞库里已建立的细胞系312

9.1　美国模式培养物保藏所（ATCC）312

9.2　欧洲细胞培养物保藏所（ECACC）312

致谢312

材料来源313

参考文献315

缩写词表319

附录 供应商名录325

索引341