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第1章 绪论1

1.1 基因工程的基本概念1

1.2 基因工程的理论和技术1

1.2.1 基因工程所依赖的核心理论1

1.2.2 基因工程所依赖的核心技术2

1.3 基因工程的建立与发展2

1.3.1 基因工程的建立2

1.3.2 基因工程的发展3

1.4 基因工程的产业化及应用6

1.4.1 产业化6

1.4.2 基因工程的应用7

1.5 转基因生物的安全性与伦理9

1.5.1 转基因生物的安全性9

1.5.2 转基因生物的伦理11

1.6 应用事例12

1.6.1 问题的提出12

1.6.2 生化产品生产中存在的问题12

1.6.3 基因工程的用途13

1.6.4 实例13

第2章 基因14

2.1 “遗传因子”——生物性状遗传的符号14

2.2 基因——位于染色体上的遗传功能单位14

2.2.1 等位基因14

2.2.2 复等位基因15

2.3 顺反子——一个基因一条多肽17

2.4 操纵子——遗传信息传递和表达的统一体18

2.5 超基因20

2.6 假基因21

2.7 断裂基因22

2.7.1 RNA剪接22

2.7.2 内含子的类型24

2.8 重叠基因27

2.9 可动基因29

2.9.1 Ac-Ds系统29

2.9.2 插入序列29

2.9.3 转座子31

2.9.4 P因子34

2.9.5 反转录转座子35

2.10 癌基因和抑癌基因36

2.11 染色体外基因37

2.11.1 质粒37

2.11.2 线粒体基因37

2.11.3 叶绿体基因39

2.11.4 非孟德尔遗传39

第3章 工具酶41

3.1 限制性核酸内切酶41

3.1.1 宿主的限制和修饰现象41

3.1.2 限制性核酸内切酶的类型42

3.1.3 限制性核酸内切酶的命名46

3.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素46

3.1.5 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用48

3.1.6 限制性核酸内切酶反应的终止49

3.1.7 限制性核酸内切酶酶切反应的操作步骤和注意事项49

3.2 DNA聚合酶50

3.2.1 DNA聚合酶Ⅰ（E.coli）51

3.2.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段52

3.2.3 T4DNA聚合酶52

3.2.4 依赖于RNA的DNA聚合酶53

3.2.5 T7DNA聚合酶53

3.2.6 修饰的T7DNA聚合酶53

3.3 DNA连接酶54

3.3.1 大肠杆菌和T4噬菌体的DNA连接酶54

3.3.2 影响连接反应的因素55

3.3.3 DNA片段在体内和体外的连接——黏性末端的连接55

3.3.4 平齐末端的连接57

3.3.5 连接反应的注意事项59

3.4 DNA及RNA的修饰酶59

3.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶59

3.4.2 T4多核苷酸激酶60

3.4.3 碱性磷酸酶61

3.5 核酸外切酶61

3.5.1 核酸外切酶Ⅶ62

3.5.2 核酸外切酶Ⅲ62

3.5.3 λ核酸外切酶和T7基因6核酸外切酶63

3.6 单链核酸内切酶63

3.6.1 S1核酸酶63

3.6.2 Ba131核酸酶64

3.7 细胞裂解酶65

3.7.1 溶菌酶65

3.7.2 蛋白酶K65

3.7.3 纤维素酶65

3.7.4 其他裂解酶66

3.8 其他66

3.8.1 琼脂糖酶66

3.8.2 核酸酶抑制剂66

第4章 载体67

4.1 质粒载体67

4.1.1 质粒的一般生物学特性67

4.1.2 质粒载体的选择71

4.1.3 常用的大肠杆菌质粒载体72

4.2 噬菌体载体79

4.2.1 单链噬菌体载体80

4.2.2 双链噬菌体载体83

4.3 柯斯质粒载体89

4.3.1 柯斯质粒载体的组成89

4.3.2 柯斯质粒载体的特点89

4.3.3 柯斯质粒载体的应用90

4.4 噬菌粒载体91

4.4.1 噬菌粒载体的概念91

4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒载体92

4.4.3 pBluescript噬菌粒载体92

4.5 人工染色体载体93

4.5.1 酵母人工染色体载体93

4.5.2 细菌人工染色体载体95

4.5.3 P1人工染色体载体96

第5章 重组DNA分子的转化与重组子筛选98

5.1 DNA分子的转化与扩增98

5.1.1 DNA重组转化的基本概念98

5.1.2 受体细胞的选择99

5.1.3 转化方法101

5.1.4 转化率及其影响因素104

5.1.5 转化细胞的扩增105

5.1.6 进行转化时的注意事项105

5.2 重组体克隆的筛选与鉴定105

5.2.1 遗传检测法106

5.2.2 物理检测法110

5.2.3 核酸杂交法112

5.2.4 PCR检测法115

5.2.5 克隆基因定位法115

5.2.6 测序检测法117

5.2.7 外源基因表达产物检测法117

第6章 大肠杆菌基因工程120

6.1 外源基因在大肠杆菌高效表达的原理120

6.1.1 启动子120

6.1.2 终止子125

6.1.3 核糖体结合位点126

6.1.4 密码子127

6.1.5 质粒拷贝数128

6.2 大肠杆菌工程菌的构建策略130

6.2.1 包涵体型异源蛋白的表达130

6.2.2 分泌型异源蛋白的表达133

6.2.3 融合型异源蛋白的表达135

6.2.4 寡聚型异源蛋白的表达138

6.2.5 整合型异源蛋白的表达142

6.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建143

6.3 重组异源蛋白的体外复性活化145

6.3.1 蛋白质变性的动力学原理145

6.3.2 折叠中间状态分子的集聚作用146

6.3.3 包涵体的溶解与变性147

6.3.4 异源蛋白的复性与重折叠149

6.4 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策154

6.4.1 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制155

6.4.2 改善基因工程菌不稳定性的策略156

6.5 大肠杆菌基因工程的案例158

第7章 酵母菌基因工程163

7.1 酵母菌的宿主系统163

7.1.1 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌163

7.1.2 抑制超糖基化作用的突变宿主菌164

7.1.3 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌164

7.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌165

7.2 酵母菌的载体系统166

7.2.1 酿酒酵母的2μ环状质粒166

7.2.2 乳酸克鲁维酵母的线型质粒167

7.2.3 果蝇克鲁维酵母的环状质粒168

7.2.4 含ARS的YRp和YEp169

7.2.5 含CEN的YCp169

7.2.6 穿梭载体170

7.3 酵母菌的转化系统171

7.3.1 酵母菌的转化程序172

7.3.2 转化质粒在酵母细胞中的命运172

7.3.3 用于转化子筛选的标记基因173

7.4 酵母菌的表达系统175

7.4.1 酵母菌启动子的基本特征与选择175

7.4.2 酵母菌启动子的可调控表达系统176

7.4.3 外源基因在酵母菌中表达的限制因素178

7.4.4 酵母菌表达系统的选择178

7.5 酵母菌基因工程的案例180

第8章 核酸的分离纯化与目的基因的克隆184

8.1 核酸的分离纯化184

8.1.1 核酸分离提取的原则184

8.1.2 核酸的分离提取185

8.1.3 质粒DNA的提取188

8.1.4 RNA的提取189

8.1.5 核酸的检测190

8.2 目的基因的克隆192

8.2.1 鸟枪法192

8.2.2 cDNA法195

8.2.3 PCR扩增法198

8.2.4 化学合成法208

8.2.5 基因文库的构建210

第9章 基因组214

9.1 基因组剖析214

9.1.1 基因组序列复杂性214

9.1.2 原核生物基因组216

9.1.3 真核生物基因组220

9.2 基因组测序227

9.2.1 DNA测序方法227

9.2.2 基因组测序234

9.2.3 序列组装236

9.3 基因组序列注释239

9.3.1 搜寻基因239

9.3.2 基因注释246

9.3.3 基因功能检测248

9.3.4 高通量基因功能研究方法249

9.4 功能基因组学251

9.4.1 组学简介251

9.4.2 转录物组251

9.4.3 蛋白质组252

9.4.4 基因本体253

9.5 基因组表观遗传256

9.5.1 什么是表观遗传256

9.5.2 位置效应258

9.5.3 DNA甲基化259

9.5.4 染色体重建259

9.6 基因组编辑260

9.6.1 遗传重组260

9.6.2 基因敲除265

9.6.3 新一代的基因组定点编辑技术269

第10章 蛋白质工程282

10.1 蛋白质工程的基本概念282

10.1.1 蛋白质工程的基本特征282

10.1.2 蛋白质工程的研究内容和应用283

10.1.3 蛋白质工程实施的必要条件283

10.2 基因的体外定向突变284

10.2.1 局部随机掺入法284

10.2.2 碱基定点转换法285

10.2.3 部分片段合成法286

10.2.4 引物定点引入法287

10.2.5 PCR扩增突变法289

10.3 基因的体外定向进化290

10.3.1 易错PCR291

10.3.2 DNA改组291

10.3.3 体外随机引发重组291

10.3.4 交错延伸292

10.3.5 过渡模板随机嵌合生长292

10.3.6 渐增切割杂合酶生成294

10.3.7 同源序列非依赖性蛋白质重组295

10.3.8 突变文库的筛选模型296

10.4 蛋白质工程的设计思想与应用297

10.4.1 提高蛋白质或酶的稳定性297

10.4.2 减少重组多肽链的错误折叠297

10.4.3 改善酶的催化活性297

10.4.4 消除酶的被抑制特性297

10.4.5 修饰酶的催化特异性298

10.4.6 强化配体与其受体的亲和性298

第11章 途径工程299

11.1 途径工程的基本概念299

11.1.1 途径工程的基本定义299

11.1.2 途径工程的基本过程300

11.1.3 途径工程的基本原理302

11.2 途径工程的研究战略303

11.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流303

11.2.2 在现存途径中改变物质流的性质304

11.2.3 利用已有途径构建新的代谢旁路305

11.3 初级代谢的途径工程305

11.3.1 发酵生产乙醇的基本战略306

11.3.2 酵母菌属乙醇发酵途径的改良308

11.3.3 高产乙醇的重组大肠杆菌的构建309

11.3.4 直接利用太阳能合成乙醇的光合细菌途径设计311

11.4 次级代谢的途径工程312

11.4.1 提高次级代谢产物的手段312

11.4.2 红霉素（聚酮类抗生素）的生物合成313

11.4.3 提高红霉素A产量的策略315

附录318

参考文献336