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第一篇 基因工程基础1

第一章 基因工程概况1

第一节 基因与基因工程1

一、基因的概念1

二、基因工程的概念3

三、基因工程的操作流程4

四、人类基因组计划5

第二节 基因工程的发展与意义7

一、基因工程的发展7

二、基因工程的研究意义10

参考文献11

第二章 核酸操作技术12

第一节 核酸操作的基本原理12

一、DNA双螺旋的变性与复性13

二、基因操作的工具15

第二节 DNA和RNA的分离提取17

一、DNA的提取17

二、RNA的提取20

第三节 核酸标记20

一、末端标记21

二、缺口平移21

三、引物原位标记法22

第四节 核酸的处理、定量与保存23

一、核酸的分离纯化23

二、凝胶电泳法分离核酸23

三、核酸的定量和保存24

参考文献24

第三章 工具酶26

第一节 限制性内切核酸酶26

一、限制性内切核酸酶的发现26

二、限制性内切核酸酶的命名方法27

三、限制性内切核酸酶的识别特点27

四、限制性内切核酸酶的切割方式28

五、内切酶星号活性30

六、内切酶反应的影响因素30

第二节 其他常用工具酶34

一、DNA连接酶34

二、DNA聚合酶36

三、修饰性工具酶40

参考文献42

第二篇 基因工程操作方法43

第四章 载体与宿主系统43

第一节 载体的种类44

一、质粒载体44

二、噬菌体载体48

三、动物细胞载体55

第二节 宿主系统56

一、原核宿主57

二、真核宿主57

参考文献58

第五章 DNA的克隆策略59

第一节 化学法合成DNA59

一、短片段直接连接法组装DNA60

二、长片段部分重叠法组装DNA60

第二节 构建文库法克隆基因61

一、构建基因组文库克隆目的基因61

二、构建cDNA文库克隆目的基因63

第三节 依据特定的DNA序列或表达产物特性克隆基因66

一、用核酸探针筛选目的DNA66

二、用寡核苷酸探针筛选目的DNA66

三、表达序列标签（EST）法筛选目的DNA67

四、转座子标签法克隆DNA67

五、依据表达产物特性筛选目的DNA67

第四节 基于mRNA反转录的差异的基因分离68

一、RACE方法分离基因68

二、差异杂交筛选目的DNA69

三、mRNA差异显示技术70

四、代表性差别分析法分离目的基因71

五、抑制差减杂交法分离目的基因72

第五节 DNA微阵列法分离基因74

一、DNA微阵列的分类74

二、DNA微阵列法分离基因的原理74

参考文献75

第六章 聚合酶链反应（PCR）77

第一节 概述77

一、PCR反应中的主要成分78

二、PCR反应过程79

三、PCR产物的克隆80

第二节 影响PCR的主要因素80

一、循环温度设计81

二、引物设计82

三、DNA聚合酶82

四、扩增平台期84

第三节 PCR反应的应用模式84

一、兼并引物PCR84

二、套式引物PCR85

三、复合PCR85

四、反向PCR86

五、不对称PCR86

六、加端PCR87

七、锚定PCR87

八、玻片PCR87

九、标记PCR和彩色PCR88

十、反转录PCR88

十一、定量PCR89

参考文献89

第七章 DNA序列分析91

第一节 传统的DNA测序方法91

一、Sanger双脱氧链终止法91

二、Maxam-Gilbert化学降解法94

第二节 DNA的自动化测序97

一、DNA自动化测序的基本原理98

二、DNA自动测序的步骤98

三、DNA自动分析仪98

第三节 DNA测序策略100

一、定向测序策略100

二、随机测序策略101

三、多路测序策略101

四、引物步移测序策略101

第四节 新一代测序仪101

一、SOLiD测序仪103

二、454测序仪103

三、Solexa高通量测序仪105

四、HeliScope测序仪105

五、新型纳米孔测序技术106

六、新一代测序技术的前景106

第五节 其他DNA测序技术106

一、质谱法106

二、杂交测序法107

三、原子探针显微镜测序法107

四、流式细胞仪测序法108

五、超薄水平凝胶电泳测序法108

参考文献108

第八章 重组子的筛选110

第一节 载体表型选择法110

一、抗药性标记及其插入失活选择法110

二、β-半乳糖苷酶显色反应选择法113

三、噬菌斑筛选法114

第二节 根据插入基因的表型选择114

第三节 DNA电泳检测法114

一、快速裂解菌落鉴定法115

二、酶切电泳筛选法115

三、PCR扩增检测法117

第四节 核酸杂交检测法118

一、核酸探针118

二、核酸杂交检测方法120

三、DNA-蛋白质筛选法125

第五节 免疫化学检测法125

一、放射性抗体测定法125

二、免疫沉淀测定法126

三、酶联免疫吸附测定法127

四、免疫印迹131

第六节 转译筛选法132

一、无细胞翻译系统132

二、转译筛选133

第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法134

一、利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞134

二、利用报告基因筛选植物转化细胞136

参考文献138

第九章 目的基因在受体细胞中的表达139

第一节 目的基因表达的条件139

一、启动子与转录起始139

二、rnRNA的有效延伸和转录终止139

三、mRNA的稳定性140

四、有效的翻译起始140

五、遗传密码应用的偏倚性141

六、mRNA的二级结构141

七、RNA的加工141

八、mRNA序列上终止密码子的选择141

九、表达质粒的拷贝数及稳定性142

十、外源蛋白的稳定性142

十一、减少基因沉默142

第二节 目的基因在大肠杆菌细胞中的表达142

一、大肠杆菌表达系统的优缺点143

二、大肠杆菌表达载体的构成143

三、目的基因在大肠杆菌中的表达形式145

四、影响目的基因表达的因素148

五、pET系统149

第三节 目的基因在酵母中的表达150

一、酵母系统的生物学特性150

二、酵母表达系统的组成150

三、酵母表达载体的类型和宿主菌151

第四节 目的基因在昆虫细胞中的表达154

一、昆虫表达系统的优势154

二、昆虫表达系统的构成155

三、重组病毒载体的筛选和改进156

四、外源基因在BEVS中的表达水平及影响因素157

五、杆状病毒表达系统的缺点158

六、家蚕生物反应器158

第五节 目的基因在哺乳动物细胞中的表达159

一、哺乳动物细胞的表达载体159

二、哺乳动物宿主细胞161

三、提高哺乳动物细胞表达的策略162

参考文献163

第三篇 基因工程应用技术165

第十章 目的蛋白的纯化与分析165

第一节 目的蛋白的分离纯化165

一、离心法166

二、沉淀法168

三、膜分离171

四、电泳法174

五、色谱法179

第二节 目的蛋白的分析184

一、紫外-可见分光光度法185

二、HPLC法和CE法187

三、质谱法188

参考文献190

第十一章 基因操作技术在医学与法医学上的应用191

第一节 基因治疗191

一、基因治疗的概念和策略191

二、基因治疗的基本过程192

三、基因治疗的临床应用研究194

第二节 基因诊断195

一、基因诊断的概念及特点196

二、基因诊断的主要技术方法196

三、基因诊断的应用197

第三节 基因工程制药198

一、基因工程药物的分类198

二、基因工程药物的发展200

三、基因工程药物产业化状况201

参考文献202

第十二章转基因生物203

第一节 转基因动物203

一、转基因动物技术的基本原理204

二、常用转基因动物的方法205

三、转基因动物的检测209

四、转基因动物的应用209

五、转基因动物研究中存在的问题与展望213

第二节 转基因植物214

一、转基因植物技术的基本原理214

二、植物转基因的常用方法215

三、转基因植物的筛选与检测216

四、转基因植物的应用216

第三节 转基因生物食品220

一、转基因食品分类221

二、转基因食品的发展状况222

参考文献222

第十三章 基因工程的安全性与发展前景224

第一节 基因工程的安全性224

一、转基因生物的安全性224

二、与基因工程产品安全性有关的重要事件226

三、生物安全政策、法规与风险评估228

四、转基因生物与国际贸易和社会经济问题230

五、转基因生物的社会伦理问题231

第二节 基因工程的发展前景233

一、基因工程在农业中应用的发展前景233

二、基因工程在生物医药中应用的发展前景235

三、基因工程在工业中应用的发展前景236

四、基因工程在其他领域中应用的发展前景237

参考文献239