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1　概述1

1.1　基因工程的基本概念1

1.1.1　基因工程的基本定义1

1.1.2　基因工程的基本过程1

1.1.3　基因工程的基本原理2

1.1.4　基因工程在生物工程中的地位2

1.2　基因工程的发展历史5

1.2.1　基因工程的诞生5

1.2.2　基因工程的成熟5

1.2.3　基因工程的腾飞6

1.3　基因工程的研究意义6

1.3.1　第四次工业大革命7

1.3.2　第二次农业大革命7

1.3.3　第四次医学大革命8

2.1 DNA重组的载体9

2 DNA重组克隆的单元操作9

2.1.1 质粒载体10

2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体15

2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体21

2.1.4 噬菌体-质粒杂合载体24

2.2 DNA的体外重组（切与接）26

2.2.1 限制性核酸内切酶26

2 2.2　T4 DNA连接酶32

2.2.3 其他用于DNA重组的工具酶33

2.2.4 DNA切接反应的影响因素36

2.2.5 DNA分子重组的方法39

2.3 DNA重组分子的转化与扩增（转与增）49

2.3.1 DNA重组转化的基本概念49

2.3.2　受体细胞的选择50

2.3.3　转化方法53

2.3.4　转化率及其影响因素56

2.4　转化子的筛选与重组子的鉴定（检）57

2.3.5　转化细胞的扩增57

2.4.1　载体遗传标记法58

2.4.2　菌落原位杂交法61

2.4.3　限制性酶切图谱法68

2.4.4　克隆基因定位法71

2.4.5　DNA序列测定法74

2.4.6　外源基因表达产物检测法81

2.5　目的基因的克隆86

2.5.1　鸟枪法86

2.5.2 cDNA法89

2.5.3 PCR扩增法99

2.5.4　化学合成法104

2.5.5　基因文库的构建108

3.1　外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理113

3.1.1 启动子113

3　大肠杆菌基因工程113

3.1.2　终止子118

3.1.3　SD序列119

3.1.4　密码子120

3.1.5　质粒拷贝数121

3.2　大肠杆菌工程菌的构建策略122

3.2.1 包涵体型异源蛋白的表达123

3.2.2　分泌型异源蛋白的表达127

3.2.3　融合型异源蛋白的表达132

3.2.4　寡聚型异源蛋白的表达136

3.2.5　整合型异源蛋白的表达140

3.2.6　蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建143

3.3　重组异源蛋白的体外复性活化145

3.3.1　包涵体的溶解与变性145

3.3.2　异源蛋白的复性与重折叠147

3.4.1 细菌生长的动力学原理152

3.4　大肠杆菌工程菌培养的最优化控制152

3.4.2　发酵过程的最优化控制155

3.4.3　大肠杆菌工程菌的高密度发酵157

3.5　基因工程菌的遗传不稳定性及其对策159

3.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制159

3.5.2　改善工程菌不稳定性的对策161

3.6　利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽163

3.6.1　重组人胰岛素164

3.6.2　重组人生长激素168

3.6.3　重组人干扰素174

3.6.4　重组人白细胞介素179

3.6.5　重组抗体及其片段183

4　非肠道原核细菌基因工程195

4.1　芽孢杆菌的基因工程195

4.1.1　芽孢杆菌的克隆载体系统195

4.1.2　芽孢杆菌的宿主转化系统200

4.1.3　芽孢杆菌的分泌表达系统201

4.1.4　重组芽孢杆菌在耐热性酶制剂大规模生产中的应用202

4.1.5　重组短小芽孢杆菌在人体蛋白药物生产中的应用206

4.1.6　重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用207

4.2　棒状杆菌的基因工程211

4.2.1　棒状菌属的克隆表达系统212

4.2.2　棒杆菌属的宿主转化系统216

4.2.3　苏氨酸基因工程菌的构建217

4.2.4　芳香族氨基酸工程菌的构建221

4.2.5　赖氨酸工程菌的构建222

4.3　链霉菌的基因工程224

4.3.1　链霉菌的载体克隆系统225

4.3.2　链霉菌的宿主转化系统228

4.3.3　链霉菌的基因表达调控系统232

4.3.4　链霉菌的蛋白分泌系统237

4.3.5　利用DNA重组技术改良抗生素生产菌239

4.4　梭菌属的基因工程240

4.4.1　梭菌属的重组克隆系统241

4.4.2　利用DNA重组技术改良有机溶剂的生产菌242

4.4.3　纤维素降解的生物机理244

4.4.4　利用纤维素类物质发酵乙醇245

4.5　乳酸菌的基因工程246

4.5.1　乳杆菌属的载体转化系统246

4.5.2　乳杆菌属的分子遗传学特性247

4.5.3　利用DNA重组技术改良食用乳杆菌的战略248

4.6　假单孢菌属的基因工程248

4.6.1　假单孢菌的宿主转化系统249

4.6.2　生物降解基因的克隆与鉴定251

4.6.3　生物降解途径的分子设计252

4.7　硫杆菌属的基因工程253

4.7.1　煤利用的优势与缺陷254

4.7.3　硫杆菌属的转化系统255

4.7.2　煤的生物脱硫与净化255

4.7.4　工程菌脱硫应用的可行性256

5　真菌基因工程257

5.1　丝状真菌的基因工程257

5.1.1　丝状真菌的载体克隆系统258

5.1.2　丝状真菌的宿主转化系统261

5.1.3　丝状真菌的表达分泌系统262

5.1.4　重组曲霉菌在重组异源蛋白生产中的应用265

5.1.5　β-内酰胺类抗生素生产菌的改良267

5.2　酵母菌的基因工程269

5.2.1 酵母菌的宿主系统269

5.2.2　酵母菌的载体系统273

5.2.3　酵母菌的转化系统279

5.2.4　酵母菌的表达系统283

5.2.5　酵母菌的蛋白修饰分泌系统290

5.2.6　利用重组酵母生产乙肝疫苗294

5.2.7 利用重组酵母生产人血清白蛋白298

6　昆虫基因工程300

6.1　果蝇的基因转化系统300

6.1.1 果蝇转座元件的结构及特征300

6.1.2 P元件介导的果蝇杂交不育302

6.1.3 P元件介导的果蝇经典转化程序303

6.2　蚊虫和农业害虫的基因改造系统305

6.2.1 用于非果蝇类昆虫转化的载体305

6.2.2　用于非果蝇类昆虫转化株筛选的遗传标记311

6.2.3　农业害虫的基因工程312

6.2.4　蚊虫的基因工程317

6.3　家蚕的基因表达系统320

6.3.1 家蚕的分子生物学320

6.3.2　基于杆状病毒的家蚕基因表达系统321

6.3.3　家蚕生物反应器的构建325

7.1.1　动物转基因的效率328

7　高等动物基因工程328

7.1　动物转基因技术的基本概念328

7.1.2　动物转基因的结构329

7.1.3　动物转基因的表达特性329

7.1.4　动物转基因的生物学效应330

7.2　转基因导入动物体内的方法331

7.2.1 转基因的动物受体细胞系统331

7.2.2　动物细胞物理转化法332

7.2.3　动物病毒转染法333

7.2.4　工程胚胎干细胞法339

7.2.5　体细胞转基因克隆法341

7.3　利用动物转基因技术研究基因的表达与功能342

7.3.1 利用转报告基因探测动物基因组的调控序列342

7.3.2　利用同源基因灭活细胞内源基因344

7.3.3　利用反义基因抑制细胞基因表达345

7.4.2　利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产结构复杂的人体蛋白347

7.4　利用转基因动物或细胞生产生物大分子347

7.4.1 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理347

7.4.3　利用动物乳腺组织生产蛋白药物350

7.5　转基因技术在动物遗传性状改良中的应用351

7.5.1　转基因鼠351

7.5.2　转基因兔、猪、羊352

7.5.3　转基因牛352

7.5.4　转基因鸡353

7.5.5　转基因鱼353

7.6　基因治疗354

7.6.1　基因治疗的基本战略思想354

7.6.2　肿瘤的基因治疗356

7.6.3　囊性纤维变性症的基因治疗358

7.6.5　重度联合免疫缺陷症的基因治疗360

7.6.6　糖尿病的基因治疗战略360

7.6.4　杜兴肌营养不良症的基因治疗360

7.6.7　骨髓细胞的转基因研究361

7.6.8　基因治疗的副反应及其对策362

8　高等植物基因工程363

8.1　高等植物的遗传学特性363

8.2　高等植物的基因转移系统365

8.2.1　Ti质粒介导的整合转化系统365

8.2.2　植物病毒介导的转染系统370

8.2.3　植物细胞的直接转化方法374

8.2.4　植物原生质体的再生375

8.3　高等植物的基因表达系统377

8.3.1 外源基因的四环素诱导系统377

8.3.2　外源基因的乙醇诱导系统379

8.3.3　外源基因的类固醇诱导系统379

8.3.4　外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统381

8.4.2　利用病毒载体探查植物基因重排382

8.4　利用植物转基因技术研究基因的表达与调控382

8.4.1 利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱382

8.4.3　利用转座元件克隆植物基因383

8.4.4　利用T-DNA构建植物遗传突变株383

8.5　利用转基因植物生产重组异源蛋白和工业原料384

8.5.1 利用植物生物反应器生产医用蛋白384

8.5.2　利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂386

8.5.3　利用植物生物反应器生产工业原料386

8.6　转基因技术在植物品种改良中的应用387

8.6.1　控制果实成熟的转基因植物387

8.6.2　抗虫害的转基因植物388

8.6.3　抗病原体的转基因植物389

8.6.4　抗除草剂的转基因植物391

8.6.5　改变花形花色的转基因植物391

8.6.6　抗环境压力的转基因植物392

8.6.7　产生高品质产物的转基因植物392

8.6.8　转基因植物的安全性393

9　第二代基因工程——蛋白质工程395

9.1　蛋白质工程的基本概念395

9.1.1　蛋白质工程的基本特征395

9.1.2　蛋白质工程的研究内容及应用396

9.1.3　蛋白质工程实施的必要条件397

9.2　基因的体外定向突变398

9.2.1　局部随机掺人法398

9.2.2　碱基定点转换法399

9.2.3　部分片段合成法399

9.2.4　引物定点引入法401

9.2.5　PCR扩增突变法402

9.3　基因的体外定向进化404

9.3.1 易错PCR406

9.3.2　DNA改组406

9.3.4　交错延伸408

9.3.3　体外随机引发重组408

9.3.5　过渡模板随机嵌合生长409

9.3.6　渐增切割杂合酶生成411

9.3.7　同源序列非依赖性蛋白质重组411

9.3.8　突变文库的筛选模型413

9.4　蛋白质工程的设计思想与应用414

9.4.1 提高蛋白质或酶的稳定性414

9.4.2　减少重组多肽链的错误折叠418

9.4.3　改善酶的催化活性418

9.4.4　消除酶的被抑制特性420

9.4.5　修饰酶的催化特异性422

9.4.6　强化配体与其受体的亲和性424

9.4.7　降低异源蛋白药物的免疫原性427

10.1　途径工程的基本概念429

10.1.1　途径工程的基本定义429

10　第三代基因工程——途径工程429

10.1.2　途径工程的基本过程431

10.1.3　途径工程的基本原理433

10.2　途径工程的研究战略434

10.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流434

10 2.2　在现存途径中改变物质流的性质437

10.2.3　利用已有途径构建新的代谢旁路438

10.3　初级代谢的途径工程440

10.3.1 乙醇生产菌的途径操作440

10.3.2　辅酶Q生产菌的途径操作447

10.3.3　氢气生产菌的途径操作453

10.4　次级代谢的途径工程454

10.4.1 聚酮生物合成的分子机制455

10.4.2　聚酮合酶各组成模件的操作战略455

10.4.3　聚酮生物合成基因的异源表达458

参考文献461