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第一章 简介1

1.1背景信息1

1.1.1什么是HPLC？1

1.1.2 HPLC能用作什么？2

1.2 HPLC的历史简介4

1.3 HPLC的一些替代技术6

1.3.1气相色谱法（GC）6

1.3.2薄层色谱法（TLC）6

1.3.3超临界流体色谱法（SFC）6

1.3.4毛细管电泳法（CE）6

1.3.5逆流色谱法7

1.3.6 HPLC的特殊形式7

1.4 HPLC的其他信息资料7

1.4.1书籍7

1.4.2期刊7

1.4.3 综述7

1.4.4 短期课程8

1.4.5互联网8

第二章 基础概念和色谱分离的控制11

2.1介绍11

2.2色谱分析的过程11

2.3保留13

2.3.1保留因子К和色谱柱的死时间to13

2.3.2分离条件和样品组成的角色15

2.4峰宽和柱塔板数N18

2.4.1 N对色谱条件的依赖性19

2.4.2峰形25

2.5分离度和方法建立26

2.5.1优化保留因子К（等式2-24中的a项）28

2.5.2优化选择性α（等式2-24中的b项）29

2.5.3优化色谱柱的塔板数N（等式2-24中的c项）30

2.5.4方法建立32

2.6进样量大小的影响34

2.6.1体积超载：样品体积对分离效果的影响34

2.6.2质量超载：样品重量对分离效果的影响35

2.6.3避免进样过多所引起的问题36

2.7其他相关的问题36

2.7.1色谱柱平衡37

2.7.2梯度洗脱37

2.7.3峰容量和二维分离37

2.7.4峰跟踪38

2.7.5二次平衡39

2.7.6 色谱柱切换39

2.7.7基于溶质的结构预测保留时间40

第三章 设备44

3.1介绍44

3.2储液瓶和溶剂的过滤45

3.2.1储液瓶的设计和使用45

3.2.2流动相的过滤46

3.3流动相的脱气46

3.3.1脱气的要求46

3.3.2氦气喷洗47

3.3.3真空和管内脱气47

3.4管线和接头48

3.4.1管线48

3.4.2接头49

3.5泵系统52

3.5.1往复活塞泵52

3.5.2在线混合53

3.5.3梯度系统55

3.5.4特殊应用55

3.6自动进样器56

3.6.1六通口进样阀56

3.6.2自动进样器的设计57

3.6.3进样量大小的影响60

3.6.4阀门的其他应用61

3.7色谱柱恒温箱62

3.7.1温度控制的要求62

3.7.2恒温箱的设计63

3.8数据系统63

3.8.1实验的辅助63

3.8.2系统控制64

3.8.3数据采集64

3.8.4数据处理64

3.8.5报告生成65

3.8.6 监管的功能65

3.9柱外效应65

3.10设备维护65

3.10.1系统性能测试65

3.10.2预防性维护68

3.10.3维修70

第四章 检测器73

4.1介绍73

4.2检测器的特征74

4.2.1一般设计74

4.2.2检测技术75

4.2.3信号、噪声、漂移和分析精确度75

4.2.4检测限77

4.2.5线性78

4.3各类检测器的介绍78

4.4 UV-可见光检测器79

4.4.1固定波长检测器80

4.4.2可变波长检测器80

4.4.3二极管阵列检测器80

4.4.4一般UV检测器的特征81

4.5荧光检测器82

4.6电化学（安培）检测器83

4.7放射性检测器84

4.8电导检测器85

4.9氮化学发光检测器85

4.10手性检测器86

4.11示差折光检测器87

4.12光散射检测器88

4.12.1蒸发光散射检测器（ELSD）88

4.12.2凝结核光散射检测器（CNLSD）89

4.12.3激光光散射检测器（LLSD）89

4.13电晕放电检测器（CAD）90

4.14质谱检测器（MS）90

4.14.1接口90

4.14.2四极杆和离子阱91

4.14.3其他质谱检测器92

4.15 其他的联用检测器92

4.15.1（傅里叶变换）红外光谱仪（FTIR）93

4.15.2核磁共振（NMR）93

4.16样品衍生化和反应检测器94

第五章 色谱柱97

5.1介绍97

5.2色谱柱载体97

5.2.1颗粒特征98

5.2.2硅胶载体99

5.2.3多孔聚合物102

5.2.4整体柱103

5.2.5其他无机颗粒104

5.3固定相105

5.3.1“键合”固定相106

5.3.2其他基于有机物的固定相108

5.3.3柱子的功能性（配合基种类）109

5.4色谱柱的选择性110

5.4.1反相柱（RPC）选择性的基础110

5.4.2柱子重现性和“等同的”柱子114

5.4.3正交分离115

5.4.4柱子选择性的其他应用115

5.5色谱柱的硬件116

5.5.1柱子接头116

5.5.2柱子配置116

5.6 色谱柱的填充方法117

5.6.1干填充法117

5.6.2硬颗粒的匀浆填充法117

5.6.3软凝胶118

5.7柱子的规格118

5.7.1生产标准118

5.7.2柱子塔板数119

5.8色谱柱的处理120

第六章 中性样品的反相色谱法124

6.1介绍124

反相色谱法的简单历史回顾125

6.2保留125

6.2.1溶剂强度126

6.2.2反相色谱的保留过程126

6.3选择性128

6.3.1溶剂强度选择性128

6.3.2溶剂类型选择性130

6.3.3温度选择性131

6.3.4 色谱柱的选择性133

6.3.5异构体分离133

6.3.6其他的选择性考量135

6.4方法建立和优化选择性的策略139

6.4.1多变量优化140

6.4.2优化色谱柱的条件143

6.5非水性反相色谱法144

6.6特殊问题145

6.6.1极性很强的样品保留较弱145

6.6.2色谱峰拖尾145

第七章 离子样品：反相、离子对和离子交换色谱法148

7.1介绍148

7.2酸碱平衡和反相保留148

7.2.1缓冲液的选择152

7.2.2 pKa与化合物结构的函数关系154

7.2.3有机溶剂和温度对流动相pH和样品pKa值的影响155

7.3反相色谱（RPC）对离子化合物的分离155

7.3.1调控保留时间156

7.3.2控制选择性156

7.3.3方法的建立160

7.3.4特殊的问题160

7.4离子对色谱法（IPC）161

7.4.1保留的基本原理162

7.4.2方法建立165

7.4.3特殊问题168

7.5离子交换色谱法（IEC）169

7.5.1保留的基本原理170

7.5.2反离子的角色170

7.5.3流动相的pH171

7.5.4 IEC柱171

7.5.5其他条件的角色171

7.5.6方法建立171

7.5.7碳水化合物的分离172

7.5.8混合模式的分离172

第八章 正相色谱175

8.1简介175

8.2正相色谱的保留行为176

8.2.1理论177

8.2.2 B溶剂和%B对溶剂强度的影响180

8.2.3以TLC的数据预测NPC的保留行为180

8.3选择性182

8.3.1溶剂强度的选择性182

8.3.2溶剂类型的选择性182

8.3.3温度的选择性184

8.3.4 色谱柱的选择性184

8.3.5异构体的分离186

8.4方法建立的总结187

8.4.1 NPC方法建立的初始条件：流动相强度和色谱柱类型的选择188

8.4.2选择性优化的策略189

8.4.3 NPC方法建立示例189

8.5 NPC应用的常见问题191

8.5.1重现性不佳191

8.5.2溶剂分层和平衡时间过长191

8.5.3 色谱峰拖尾192

8.6亲水作用色谱法192

8.6.1保留机制192

8.6.2色谱柱193

8.6.3亲水作用色谱方法建立193

8.6.4 亲水作用色谱的常见问题194

第九章 梯度洗脱197

9.1引言197

9.1.1使用梯度洗脱的其他原因198

9.1.2梯度的形状199

9.1.3等度洗脱和梯度洗脱的相似之处199

9.2实验条件及它们对分离的影响202

9.2.1 色谱柱条件改变的影响203

9.2.2梯度洗脱条件改变的影响204

9.2.3“非常规”的样品209

9.2.4 定量测定的关系210

9.3方法建立212

9.3.1起始的梯度分离212

9.3.2优化К216

9.3.3优化梯度选择性α216

9.3.4优化梯度范围216

9.3.5分段（非线性）洗脱217

9.3.6优化色谱柱的塔板数N217

9.3.7测量色谱柱的必要平衡时间217

9.3.8方法的重现性218

9.3.9色谱峰容量和快速分离219

9.3.10全面的二维HPLC222

9.4大分子的分离225

9.5其他分离模式226

9.5.1理论226

9.5.2正相色谱法NPC）226

9.5.3亲水作用色谱法（HILIC）226

9.5.4离子交换色谱法（IEC）227

9.6问题228

9.6.1溶剂混合228

9.6.2鬼峰228

9.6.3基线漂移228

第十章 计算机辅助的方法开发231

10.1介绍231

10.1.1计算机模拟的基础和历史231

10.1.2什么时候使用计算机模拟233

10.2计算机模拟软件234

10.2.1 DryLab操作234

10.2.2梯度优化235

10.2.3其他特点235

10.2.4色谱峰跟踪238

10.2.5计算机模拟软件的来源239

10.3其他方法建立的软件239

10.3.1溶质保留和分子结构239

10.3.2溶质pKa值与分子结构239

10.3.3反相色谱柱的选择239

10.3.4用于方法建立的专家系统239

10.4计算机模拟与方法建立239

10.4.1举例1：药物混合物的分离240

10.4.2举例2：方法建立的不同策略240

10.4.3验证方法的耐受性241

10.4.4总结241

第十一章 定性与定量分析244

11.1介绍244

11.2信号测量244

11.2.1积分操作244

11.2.2保留247

11.2.3峰的大小248

11.2.4误差的来源248

11.2.5检测限250

11.3定性分析251

11.3.1保留时间252

11.3.2在线定性分析252

11.4定量分析253

11.4.1校正253

11.4.2痕量分析258

11.5总结258

第十二章 方法验证260

12.1前言260

12.2术语及定义261

12.2.1准确度262

12.2.2精确度262

12.2.3专属性263

12.2.4检测限及定量限263

12.2.5线性及范围263

12.2.6耐受性264

12.3系统适应性264

12.4文件265

12.4.1确证草案265

12.4.2检测方法265

12.4.3确证报告266

12.5不同药品分析方法的确证266

12.5.1第一类方法266

12.5.2第二类方法266

12.5.3第三类方法267

12.5.4第四类方法267

12.6生物分析方法267

12.6.1参考标准物的制备267

12.6.2生物分析法的建立与确证267

12.6.3生物分析法常规应用269

12.6.4生物分析法文件269

12.7分析方法的移交（AMT）269

12.7.1分析方法移交选项270

12.7.2 AMT精要271

12.7.3 AMT潜在缺陷272

12.8方法调整或方法修正272

12.8.1 pH的调试273

12.8.2缓冲盐溶液的浓度273

12.8.3流动相组成成分的比例273

12.8.4紫外可见光检测器的波长274

12.8.5温度的调节274

12.8.6柱长、直径和颗粒大小的调整274

12.9质量控制和质量保证274

12.9.1质量控制274

12.9.2质量保证274

12.10总结274

第十三章 生物化学与合成聚合物的分离277

13.1生物大分子277

13.2分子的结构与构象277

13.2.1肽类和蛋白质（多肽）278

13.2.2核酸280

13.2.3碳水化合物281

13.2.4病毒281

13.3生物分子高效液相色谱的特殊考虑281

13.3.1色谱柱的特性283

13.3.2蛋白质结构对色谱行为的影响284

13.4肽类和蛋白质的分离285

13.4.1反相色谱法（RPC）285

13.4.2离子交换色谱（IEC）和相关技术291

13.4.3疏水性相互作用色谱（HIC）297

13.4.4亲水作用色谱（HILIC）298

13.4.5多维液相色谱（MDLC）在蛋白质组学上的应用300

13.5核苷酸分离301

13.5.1阴离子交换色谱301

13.5.2反相色谱302

13.5.3疏水作用色谱分析法304

13.6分离碳水化合物305

13.6.1亲水作用色谱305

13.6.2离子对分配色谱306

13.6.3高效阴离子交换色谱306

13.7病毒的分离306

13.8尺寸排阻色谱法（SEC）308

13.8.1尺寸排阻色谱法的保留过程308

13.8.2凝胶过滤色谱柱309

13.8.3凝胶过滤的流动相310

13.8.4操作的考虑因素310

13.8.5 SEC的优点和局限性311

13.8.6 SEC的应用311

13.9生物大分子的大规模纯化312

13.9.1背景312

13.9.2重组人胰岛素的生产规模的纯化312

13.9.3制备液相色谱分离蛋白质的一般要求315

13.10合成聚合物315

13.10.1背景315

13.10.2聚合物的分析技术316

13.10.3聚合物分析的液相色谱模式317

13.10.4二维色谱分离聚合物319

第十四章 对映异构体的分离325

14.1引言325

14.2背景和定义325

14.2.1异构和手性326

14.2.2手性的识别和对映异构体的分离327

14.3间接方法327

14.4直接方法329

14.4.1手性流动相-添加物模式（CMPA）329

14.4.2手性固定相模式（CSP）330

14.4.3手性识别的原则331

14.5色谱峰的展宽和拖尾332

14.6手性固定相和它们的特征332

14.6.1基于多糖的CSPs332

14.6.2合成聚合物CSPs336

14.6.3蛋白质相338

14.6.4基于环糊精的CSPs341

14.6.5大环抗生素CSPs342

14.6.6手性冠醚CSPs346

14.6.7供体-受体相346

14.6.8手性离子交换剂348

14.6.9手性配体-交换CSPs350

14.7热力学的考虑350

14.7.1溶质-选择剂结合的热力学问题350

14.7.2对映异构体直接色谱分离法的热力学问题351

14.7.3位点选择性的热力学问题351

第十五章 制备色谱357

15.1引言357

15.1.1色谱柱超载及其后果357

15.1.2分离的规模358

15.2制备-LC分离的装置359

15.2.1色谱柱359

15.2.2样品引入359

15.2.3检测器360

15.2.4试样收集361

15.2.5产品回收（流动相的去除）361

15.3等度洗脱362

15.3.1样品重量和分离362

15.3.2触-峰分离363

15.4严重超载的分离366

15.4.1回收率与纯度366

15.4.2方法建立366

15.5梯度洗脱368

15.5.1等度和梯度制备-LC的比较368

15.5.2梯度制备-LC的方法建立369

15.6大规模分离370

第十六章 样品的制备371

16.1引言371

16.2样品的类别372

16.3固体和半固体样品的初步处理373

16.3.1样品颗粒的减小373

16.3.2样品的干燥373

16.3.3 过滤373

16.4液体样品的制备374

16.5液-液萃取374

16.5.1理论374

16.5.2实践375

16.5.3问题376

16.5.4液-液萃取的特殊方法376

16.6固相萃取377

16.6.1 SPE和HPLC比较377

16.6.2使用SPE377

16.6.3 SPE的仪器378

16.6.4 SPE的工具379

16.6.5 SPE方法建立380

16.6.6 SPE方法建立的例子：从人血浆中分离沙丁胺醇381

16.6.7 SPE中的特殊问题383

16.7样品制备中的膜技术385

16.8固体样品的制备方法385

16.8.1传统萃取方法385

16.8.2现代固体萃取方法387

16.9色谱柱的切换388

16.10生物色谱法的样品配备388

16.11 LC-MS的样品配备389

16.12应用于HPLC的衍生化技术390

第十七章 故障排除395

快速修复395

17.1前言395

17.2如何阻止问题的产生396

17.2.1系统表现测试396

17.2.2周期性的维护396

17.2.3系统适应性测试396

17.2.4历史记录397

17.2.5建议和技巧397

17.3故障分割的策略399

17.3.1划分与征服399

17.3.2简易的与有效的400

17.3.3 每次只改变一个变量400

17.3.4解决重现性的问题400

17.3.5单元组件的替换400

17.3.6还原400

17.4 HPLC故障的常见特征400

17.4.1漏泄400

17.4.2非正常的压力404

17.4.3保留时间的变动406

17.4.4 峰面积408

17.4.5其他与色谱有关的故障409

17.4.6系统表现测试的解析417

17.5故障排除的表格421

附录Ⅰ HPLC溶剂的特点427

Ⅰ.1溶剂-检测器兼容性427

Ⅰ.1.1 UV检测427

Ⅰ.1.2 RⅠ检测器427

Ⅰ.1.3 MS检测器427

Ⅰ.2溶剂的极性与选择性429

Ⅰ.3溶剂安全性429

附录Ⅱ缓冲流动相的制备432

Ⅱ.1操作顺序432

Ⅱ.2常用缓冲液的制法432