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第一章 基因工程概论1

第一节 基因及其研究历程1

一、基因学说的创立1

二、基因与DNA分子2

三、基因中遗传信息的传递与表达3

四、基因与蛋白质多肽链3

五、基因碱基序列与蛋白质氨基酸序列4

六、基因的结构与功能4

七、基因的表达与调控6

八、基因的分离与克隆7

九、基因的构建与表达8

第二节 基因工程的发展9

一、理论上的三大发现9

二、技术的三大发明10

三、植物基因工程的发展简史11

第三节 基因工程的概念与主要内容12

一、基因工程的概念和特点12

二、作物基因工程的主要研究内容13

第四节 作物基因工程的应用16

一、作物基因工程的应用现状16

二、转基因作物商业化中存在的问题18

思考题18

参考文献18

第二章 基因工程的工具20

第一节 植物核酸及蛋白质的分离与制备20

一、植物核酸的制备20

二、植物蛋白质的分离与纯化25

第二节 凝胶电泳的基本原理28

一、凝胶电泳的基本原理29

二、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳29

三、RNA的变性凝胶电泳30

四、脉冲电场凝胶电泳31

五、核酸凝胶电泳的常见问题32

六、蛋白质的凝胶电泳33

第三节 基因工程的工具酶33

一、限制性内切核酸酶（限制酶）34

二、甲基化酶37

三、DNA连接酶37

四、DNA聚合酶39

第四节 分子杂交技术43

一、DNA印迹法43

二、RNA印迹法45

三、斑点印迹法和狭线印迹法45

四、菌落印迹或噬菌斑印迹46

五、基因芯片杂交47

第五节 PCR基因扩增技术47

一、PCR的原理47

二、PCR反应体系48

三、PCR条件的选择49

四、PCR条件的优化50

五、常用PCR技术及其应用50

第六节 基因工程的载体51

一、质粒载体52

二、λ噬菌体和M13噬菌体载体54

三、cosmid（柯斯质粒）和phagemid载体系列56

四、酵母载体58

五、农杆菌Ti质粒载体60

六、植物病毒载体62

第七节 文库构建的基本原理及应用63

一、基因组文库与cDNA文库64

二、克隆文库及表达文库65

三、减法文库65

四、亚克隆文库65

第八节 核酸与蛋白质测序的原理与技术65

一、DNA测序技术65

二、蛋白质测序技术69

第九节 生物信息学技术72

一、生物信息学数据库72

二、数据库查询73

三、数据库搜索74

四、基因序列分析75

五、电子克隆技术76

思考题77

参考文献78

第三章 目的基因的克隆与功能分析79

第一节 基因组策略79

一、基因组文库筛选目的基因79

二、图位克隆目的基因83

三、突变体分析克隆目的基因89

四、已知DNA片段侧翼基因组序列的分离96

第二节 转录组策略100

一、mRNA差异显示分析筛选目的基因101

二、cDNA文库筛选目的基因103

三、基因表达系列分析（SAGE）筛选目的基因106

四、基因芯片分析筛选目的基因108

五、cDNA末端的快速克隆（RACE技术）110

第三节 功能蛋白质组策略分离基因112

一、功能蛋白质组策略概述112

二、蛋白质双向电泳技术113

三、功能蛋白的鉴定及氨基酸序列分析115

四、功能蛋白基因的分离119

第四节 目的基因分离的策略123

一、目的基因分离的策略123

二、基因分离克隆策略的选择123

第五节 基因功能的初步分析与鉴定124

一、通过mRNA检测分析基因的表达谱124

二、通过检测蛋白质分析基因的表达特征125

三、通过功能获得和（或）功能缺失分析基因功能125

思考题126

参考文献126

第四章 基因表达载体的构建128

第一节 基因的表达与调控128

一、基因表达调控是生命活动的必需128

二、原核生物的基因表达与调控129

三、真核生物的基因表达调控133

第二节 目的基因的表达与功能分析137

一、目的基因功能与表达分析的策略137

二、基因表达载体构建的基本原理138

第三节 农杆菌Ti质粒转化载体的构建146

一、根癌农杆菌研究的历史146

二、Ti质粒的结构147

三、T-DNA的结构与功能152

四、基于Ti质粒的转化载体的系统演化157

五、Ti质粒载体的构建策略161

六、常用Ti质粒双元载体的构建163

第四节 植物基因表达载体构建实例171

一、植物基因表达载体构建和优化策略171

二、基因表达载体构建的实例176

三、选择标记基因和报告基因的特点与选择181

第五节 植物病毒载体的构建185

一、基于基因组操作的植物病毒表达载体185

二、基于基因转录机制的病毒表达载体186

三、VIGS载体的构建及应用187

四、植物病毒载体的应用190

第六节 基因沉默技术原理190

一、RNA干扰技术原理和应用191

二、基因定点敲除技术192

思考题197

参考文献197

第五章 作物的遗传转化与转化体筛选199

第一节 作物基因转化受体系统199

一、作物基因转化受体系统的条件199

二、作物基因转化受体系统的类型及其特性201

三、作物基因转化受体系统建立的程序203

四、作物基因转化受体系统建立中的常见问题205

第二节 农杆菌介导的遗传转化207

一、农杆菌的生物学特性208

二、常用根癌农杆菌及其特性208

三、根癌农杆菌介导的转化程序209

四、影响根癌农杆菌T-DNA转移的因素209

五、根癌农杆菌介导的遗传转化技术213

六、根癌农杆菌转化系统评价219

第三节 基因枪介导的遗传转化219

一、基因枪法的原理及其优缺点219

二、基因枪转化小麦未成熟胚的技术流程220

三、注意事项222

第四节 花粉管通道介导的遗传转化222

一、花粉管通道法的技术原理223

二、花粉管通道法的操作程序223

三、花粉管通道法的应用224

第五节 其他常用遗传转化方法225

一、显微注射法225

二、聚乙二醇（PEG）介导法227

三、电穿孔法229

四、病毒介导的遗传转化230

参考文献232

第六章 转基因植株的鉴定及利用234

第一节 转基因植株鉴定的策略234

一、转基因植株鉴定的证据234

二、外源基因的检测与鉴定策略234

三、转基因植株鉴定的步骤235

第二节 选择标记基因与报告基因的检测235

一、抗抗生素类236

二、抗除草剂类237

三、报告基因类238

第三节 目的基因的检测与分析240

一、分子杂交240

二、转基因植物的PCR-Southern blotting检测242

三、外源基因表达水平的RT-PCR检测243

四、外源基因拷贝数的检测244

五、外源基因检测的衍生方法246

第四节 目的基因的整合及效应247

一、转基因植物中外源DNA的整合特性247

二、转基因植物中外源DNA整合的遗传效应251

三、提高外源基因表达效率的策略252

第五节 目的基因的遗传特性254

一、转基因的遗传传递规律254

二、转基因的遗传稳定性259

三、外界环境对转基因遗传特性的影响261

第六节 作物转基因材料在育种中的应用261

一、回交育种261

二、转基因材料回交育种的特点266

三、转基因快速、定向育种技术（以小麦为例）267

思考题269

参考文献270

第七章 作物基因工程的安全性评价272

第一节 基因工程安全性的争论272

一、问题的由来272

二、初步对策——安全准则273

第二节 转基因作物的安全评价274

一、为什么要对转基因作物进行安全性评价？274

二、转基因作物安全性评价的主要内容275

三、国内外转基因作物的安全性评价概况280

第三节 转基因作物——恶魔还是救星281

思考题282

参考文献282

附录 作物基因工程主要实验技术284

一、植物基因组DNA提取284

二、植物基因组DNA的纯度检测285

三、基因的PCR扩增287

四、质粒DNA的线性化与连接重组288

五、重组DNA的遗传转化290

六、质粒DNA的电泳检测291

七、植物总RNA的提取292

八、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳294

九、植物组织全蛋白的提取295

十、植物可溶性蛋白含量的考马斯亮蓝染色法测定296

十一、植物可溶性蛋白含量的紫外吸收法测定298

十二、禾谷类作物种子醇溶蛋白的毛细管电泳300

十三、禾谷类种子醇溶蛋白A-PAGE鉴定301

十四、蛋白质的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析303

十五、植物组织蛋白质的双向电泳304

十六、小麦的SSR分子标记分析308

十七、小麦BSMV-VIGS解析基因功能310

十八、作物基因工程综合大实验312

参考文献319