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第1章 概述1

1.1 基因工程的基本概念1

1.2 基因工程的发展历史5

1.3 基因工程的研究意义7

第2章 基因表达调控的原理与技术10

2.1 启动子调控模型10

2.1.1 启动子的组成及其功能10

2.1.2 启动子的顺式增强作用14

2.1.3 启动子的反式协同作用16

2.1.4 启动子结构的多样性19

2.2 操纵子调控模型22

2.2.1 操纵子基因表达调控的基本原理22

2.2.2 乳糖操纵子24

2.2.3 半乳糖操纵子28

2.2.4 阿拉伯糖操纵子29

2.2.5 色氨酸操纵子30

2.2.6 λ噬菌体的操纵子31

2.3 感受应答调控模型34

2.3.1 感受应答调控模型的基本原理34

2.3.2 真核生物转录调控元件的相互作用37

2.3.3 真核生物转录调控因子的激活方式39

2.4 RNA结构调控模型40

2.4.1 终止子的工作原理40

2.4.2 衰减子的工作原理42

2.4.3 反义子的工作原理44

2.5 RNA剪切编辑调控模型46

2.6 基因工程的支撑技术47

2.6.1 核酸凝胶电泳技术47

2.6.2 核酸分子杂交技术49

2.6.3 细菌转化转染技术55

2.6.4 聚合酶链反应技术59

2.6.5 DNA序列分析技术64

2.6.6 寡核苷酸合成技术67

2.6.7 基因定点突变技术70

第3章 基因工程的单元操作74

3.1 工具酶74

3.1.1 限制性核酸内切酶74

3.1.2 T4 DNA连接酶79

3.1.3 DNA聚合酶79

3.1.4 核酸酶82

3.1.5 核酸修饰酶83

3.2 载体84

3.2.1 质粒载体85

3.2.2 λ双链噬菌体DNA载体90

3.2.3 M13单链噬菌体DNA载体95

3.2.4 噬菌体／质粒杂合载体97

3.2.5 人造染色体载体99

3.3 受体细胞99

3.4 DNA的体外重组（切与接）101

3.4.1 DNA切接反应的影响因素102

3.4.2 DNA分子重组的方法105

3.5 重组DNA分子的转化与扩增（转与增）112

3.5.1 转化率及其影响因素112

3.5.2 转化细胞的扩增114

3.6 转化子的筛选与重组子的鉴定（检）114

3.6.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定114

3.6.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定117

3.6.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定123

3.7 目的基因的克隆126

3.7.1 鸟枪法126

3.7.2 cDNA法129

3.7.3 PCR扩增法137

3.7.4 化学合成法141

3.7.5 基因文库的构建142

第4章 大肠杆菌的基因工程147

4.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理147

4.1.1 启动子147

4.1.2 终止子152

4.1.3 SD序列153

4.1.4 密码子154

4.1.5 质粒拷贝数155

4.2 大肠杆菌工程菌的构建策略157

4.2.1 包涵体型异源蛋白的表达157

4.2.2 分泌型异源蛋白的表达161

4.2.3 融合型异源蛋白的表达164

4.2.4 寡聚型异源蛋白的表达168

4.2.5 整合型异源蛋白的表达171

4.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建173

4.3 重组异源蛋白的体外复性活化175

4.3.1 包涵体的溶解与变性175

4.3.2 异源蛋白的复性与重折叠177

4.4 大肠杆菌工程菌培养的最优化控制182

4.4.1 细菌生长的动力学原理182

4.4.2 发酵过程的最优化控制184

4.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵187

4.5 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策189

4.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制189

4.5.2 改善工程菌不稳定性的对策190

4.6 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素193

4.6.1 胰岛素的结构及其生物合成193

4.6.2 人胰岛素的生产方法194

4.6.3 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略195

第5章 酵母的基因工程198

5.1 酵母的受体系统198

5.1.1 提高重组异源蛋白产率的突变型受体198

5.1.2 抑制超糖基化作用的突变型受体199

5.1.3 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体200

5.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变型受体201

5.2 酵母的载体系统202

5.2.1 酿酒酵母中的2μ环状质粒202

5.2.2 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒203

5.2.3 果蝇克鲁维酵母中的环状质粒203

5.2.4 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建204

5.2.5 含有CEN的YCp载体及其构建205

5.2.6 含有TEL的YAC载体及其构建205

5.3 酵母的转化系统207

5.3.1 酵母的转化程序207

5.3.2 转化质粒在宿主细胞中的命运208

5.3.3 用于转化子筛选的标记基因209

5.4 酵母的表达系统211

5.4.1 酵母启动子的基本特征与选择211

5.4.2 酵母启动子的可调控表达系统212

5.4.3 外源基因在酵母中表达的限制性因素214

5.4.4 酵母表达系统的选择215

5.5 酵母的蛋白修饰分泌系统219

5.5.1 酵母的蛋白质分泌运输机制219

5.5.2 酵母的信号肽及其剪切系统220

5.5.3 酵母分泌型蛋白的糖基化修饰221

5.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗224

5.6.1 乙肝病毒的结构224

5.6.2 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母构建225

5.6.3 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母构建225

5.7 利用重组酵母生产人血清清蛋白226