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绪论1

第一节 基因工程的概念1

第二节 基因工程的诞生与发展2

一、基因工程诞生的理论基础2

二、基因工程的诞生3

三、基因工程的发展4

第三节 基因工程研究的内容5

一、基因工程研究的主要内容5

二、基因工程的基本操作程序7

三、基因工程的基本操作内容7

第四节 基因工程的意义与发展前景7

一、基因工程的意义7

二、基因工程的发展前景8

本章小结8

思考题8

第一章 基因工程的分子生物学基础9

第一节 细胞的分类9

一、原核细胞10

二、真核细胞10

第二节 DNA的复制、修复与重组10

一、DNA结构10

二、DNA复制11

三、DNA修复12

四、DNA重组13

第三节 RNA转录与加工14

一、原核基因的转录与调节14

二、真核基因的转录与调节16

三、mRNA加工17

本章小结19

思考题20

第二章 基因工程工具酶21

第一节 限制性核酸内切酶21

一、寄主的限制和修饰现象21

二、限制性核酸内切酶的类型22

三、限制性核酸内切酶的命名23

四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性24

五、Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件27

六、影响限制性核酸内切酶活性的因素29

第二节 DNA连接酶31

一、概念与机理31

二、DNA连接酶的种类32

三、DNA连接酶的反应体系33

四、影响连接反应的因素33

第三节 DNA聚合酶34

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ35

二、Klenow片段36

三、T4噬菌体DNA聚合酶37

四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶38

五、Taq DNA聚合酶38

六、逆转录酶38

第四节 末端脱氧核苷酸转移酶39

第五节 核酸酶40

一、核糖核酸酶40

二、脱氧核糖核酸酶Ⅰ41

三、S1核酸酶42

第六节 核酸外切酶43

一、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ44

二、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ44

三、Bal 31核酸酶45

第七节 T4噬菌体多核苷酸激酶46

一、T4噬菌体多核苷酸激酶的性质46

二、多核苷酸激酶的用途47

第八节 碱性磷酸酶47

一、碱性磷酸酶的性质47

二、碱性磷酸酶的用途48

本章小结48

思考题50

第三章 基因工程载体51

第一节 质粒载体51

一、质粒的生物学特性51

二、理想质粒载体的必备条件53

三、质粒载体的构建54

四、常用的质粒载体类型58

第二节 λ噬菌体载体61

一、λ噬菌体的生物学特性61

二、λ噬菌体载体的构建63

三、常用的λ噬菌体载体64

第三节 单链DNA噬菌体载体66

一、M13噬菌体的生物学特性66

二、M13噬菌体载体的构建67

三、M13噬菌体载体的主要用途68

四、噬菌体载体69

第四节 黏粒载体69

一、黏粒载体的基本特点70

二、黏粒载体的构建70

三、黏粒载体在基因克隆中的应用71

四、常用的黏粒载体及应用72

第五节 其他载体73

一、人工染色体73

二、植物基因工程载体74

三、动物基因工程载体77

第六节 表达载体82

一、表达载体构建的一般原则83

二、植物表达载体85

本章小结91

思考题91

第四章 分子基本操作技术92

第一节 DNA基本操作技术92

一、基因组DNA提取技术92

二、质粒DNA提取技术96

三、凝胶电泳技术99

四、DNA片段纯化与回收技术103

第二节 RNA基本操作技术104

一、总RNA提取技术105

二、mRNA提取技术108

第三节 核酸分子杂交技术110

一、探针的制备110

二、核酸杂交技术112

本章小结115

思考题115

第五章 聚合酶链式反应技术116

第一节 PCR扩增原理116

第二节 PCR反应体系117

一、PCR操作程序117

二、PCR反应成分118

三、PCR反应条件120

第三节 PCR引物设计原则120

一、引物设计的一般原则121

二、引物3′端的末位碱基121

三、引物设计软件121

第四节 PCR技术类型及应用123

一、已知DNA序列的PCR扩增123

二、逆转录PCR125

三、已知cDNA一端序列获得全长cDNA的PCR125

四、已知侧翼序列PCR扩增127

五、未知序列PCR扩增130

六、定量PCR132

七、免疫相关PCR132

八、PCR技术衍生的分子标记133

九、PCR技术的应用133

本章小结134

思考题134

第六章 基因文库的构建135

第一节 基因组DNA文库的构建135

一、构建基因组文库的载体135

二、基因组DNA克隆片段的制备138

三、重组DNA分子的产生139

四、基因组文库的产生140

五、基因组文库的大小及代表性141

六、基因组文库的扩增与保存141

第二节 cDNA文库的构建142

一、mRNA的提取142

二、cDNA克隆载体的选择143

三、cDNA克隆片段的获得143

四、cDNA文库的生成147

五、cDNA文库的质量分析148

六、cDNA文库的扩增与保存148

七、cDNA末端的快速扩增149

第三节 差减cDNA文库的构建149

一、基本原理149

二、杂交方法149

三、载体选择151

第四节 基因库与畜禽遗传资源保护151

一、国内外畜禽遗传资源保护的现状151

二、畜禽遗传资源保存的方式152

本章小结153

思考题154

第七章 目的基因的获取155

第一节 对已知序列基因的分离155

一、化学合成法155

二、从基因文库中钓取目的基因156

三、逆转录法获得真核目的基因158

第二节 对未知序列基因的分离159

一、染色体步移159

二、杂交捕捉和释放159

三、mRNA的差异显示分析160

四、限制性标志cDNA扫描160

五、“电子”cDNA文库筛选160

第三节 从cDNA文库中获得目的基因160

一、从非全长cDNA文库中筛选新基因161

二、从全长cDNA文库中进行杂交筛选161

本章小结162

思考题162

第八章 DNA体外重组与基因转移163

第一节 重组DNA分子的构建163

一、重组DNA的概念163

二、载体DNA与外源基因片段的连接163

第二节 基因转移171

一、重组DNA向细菌细胞转入171

二、外源目的基因向真核细胞转入173

本章小结175

思考题175

第九章 重组子的筛选与鉴定176

第一节 遗传学检测法177

一、根据载体表型特征的筛选177

二、根据插入基因遗传性状的筛选178

第二节 核酸分子杂交178

一、菌落印迹原位杂交179

二、斑点印迹杂交179

三、Southern印迹杂交180

第三节 物理检测法180

一、直接凝胶电泳检测法180

二、限制性核酸内切酶酶切片段分析法181

三、R-环检测法182

第四节 免疫化学检测法182

一、放射性抗体检测法182

二、免疫沉淀检测法183

三、Western印迹分析法183

第五节 核酸序列分析及其他方法184

一、核酸序列分析184

二、PCR法184

三、Northern印迹分析184

本章小结184

思考题185

第十章 外源基因的表达186

第一节 外源基因在大肠杆菌中的表达186

一、正确表达的基本条件187

二、常用的大肠杆菌表达载体187

三、外源蛋白质表达部位193

四、提高外源基因表达效率的方法194

五、表达产物的检测198

六、表达实例：人生长素基因在大肠杆菌中的表达200

第二节 真核细胞表达系统概述203

一、酵母表达体系203

二、昆虫细胞表达体系204

三、哺乳动物细胞表达体系205

本章小结206

思考题206

第十一章 微生物基因工程207

第一节 细菌基因工程207

一、实现外源基因表达的基本操作207

二、大肠杆菌工程菌的构建策略210

三、基因工程菌遗传不稳定性及其对策219

四、细菌表达外源蛋白的流程222

第二节 酵母菌的基因工程223

一、酵母菌的宿主系统223

二、酵母菌的载体系统225

三、酵母菌的转化系统229

四、酵母菌的表达系统230

五、酵母菌的蛋白修饰分泌系统231

第三节 其他微生物系统在基因工程中的利用233

一、芽孢杆菌在基因工程中的应用234

二、棒状杆菌在基因工程中的应用237

三、假单胞杆菌在基因工程中应用237

四、链霉菌在基因工程中的应用237

第四节 微生物基因工程的应用238

一、重组微生物工程菌与人类药物生产238

二、重组微生物工程菌与疫苗生产242

三、重组微生物工程菌与食品、饲料工业245

四、重组微生物工程菌与环境保护249

五、重组微生物工程菌与农业生产251

本章小结256

思考题256

第十二章 植物基因工程258

第一节 农杆菌及其转化体系258

一、根癌农杆菌的生物学特征258

二、Ti质粒的结构和功能259

三、Ti质粒的转化机理260

四、农杆菌Ti质粒载体的改造与表达载体的构建262

五、Ri质粒载体系统265

第二节 目的基因的导入266

一、植物转化的受体系统266

二、基因的导入方法267

第三节 外源基因的表达、检测与遗传特性273

一、转基因植物外源基因的表达及其调控273

二、外源基因的检测276

三、转基因植物的遗传特性278

第四节 植物基因工程的应用279

一、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用279

二、改良植物品种281

三、转基因植物作为生物反应器286

本章小结290

思考题291

第十三章 动物基因工程292

第一节 动物基因工程的概念与发展292

第二节 动物目的基因的选择与表达载体的构建293

一、动物转基因操作的一般程序293

二、目的基因的选择294

三、表达载体的构建294

四、外源基因的组织特异性表达300

第三节 基因导入的方法300

一、DEA？-葡聚糖转染法300

二、显微注射法301

三、病毒转染法302

四、胚胎干细胞介导法303

五、精子载体法303

六、基因同源重组法304

第四节 转基因动物的鉴定306

一、DNA水平的检测306

二、RNA水平的检测307

三、目的蛋白的检测307

第五节 动物基因工程技术的应用308

一、动物基因工程技术的应用308

二、动物转基因技术存在的问题314

三、提高转基因动物外源基因表达水平的方法与途径315

四、转基因动物的应用前景317

第六节 基因诊断318

一、基因诊断的基本方法318

二、基因芯片与疾病诊断319

第七节 基因治疗320

一、基因治疗概述320

二、基因治疗的方式321

三、基因治疗的前景324

第八节 基因工程疫苗325

一、基因工程活载体疫苗325

二、基因缺失疫苗326

三、基因工程亚单位疫苗327

四、合成肽疫苗327

五、转基因植物可食疫苗327

六、DNA疫苗328

本章小结328

思考题329

第十四章 生物信息学330

第一节 生物信息学概论330

一、蛋白质和核酸序列的测定330

二、生物大分子空间结构的测定331

三、生物学信息的迅猛增长331

四、生物信息学的基本概念及研究内容332

五、生物信息学研究的热点领域333

第二节 生物信息数据库334

一、核酸序列数据库335

二、蛋白质序列数据库340

三、大分子空间结构数据库342

四、基因组数据库345

第三节 数据的查询、提交和搜索346

一、Entrez查询系统346

二、SRS数据库查询系统348

三、数据提交352

第四节 序列比对和数据库搜索353

一、序列比对原理353

二、Blast355

第五节 多序列比对及系统发育分析360

一、多序列比对分析360

二、系统发育分析362

本章小结365

思考题365

第十五章 分子标记及其他相关技术366

第一节 分子标记技术366

一、分子标记的概念366

二、分子标记的类型367

三、标记系统在应用时的选择375

四、分子标记的应用377

第二节 基因芯片技术和应用379

一、基因芯片的概念379

二、基因芯片的类型380

三、基因芯片的实验操作380

四、基因芯片的应用382

五、使用基因芯片时应注意的问题383

第三节 差异显示技术及其应用385

一、mRNA差异显示技术385

二、扣除杂交或消减杂交技术388

三、代表性差异分析（RDA）和抑制性扣除杂交（SSH）389

四、基因表达系列分析（SAGE）391

五、差异显示技术的应用392

本章小结394

思考题394

第十六章 基因工程规则、专利及安全性396

第一节 基因工程研究实验室安全性基本要求396

第二节 基因工程产品的释放规则及要求397

一、基因工程药物投放的规则和要求397

二、转基因植物品种的释放要求398

三、ISO认证399

第三节 现代生物技术专利400

一、专利申请的要求400

二、现代生物技术专利类型401

三、专利的地域性402

四、专利与基础研究402

第四节 现代生物技术的社会伦理问题403

第五节 基因工程产品的安全性问题403

一、环境安全性404

二、食品安全性404

本章小结406

思考题406

主要参考文献407