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第一章 脱氧核糖核酸（DNA）1

第一节 DNA的提取1

一、质粒DNA的提取1

（一）细菌质粒DNA的小量制备1

（二）细菌质粒DNA的大量制备7

（三）酵母质粒DNA的分离11

二、基因组DNA的提取14

（一）细菌基因组DNA的制备14

（二）哺乳动物细胞基因组DNA的提取15

（三）真核生物DNA分离的一般方法17

（四）从植物中分离基因组DNA18

（五）用CTAB提取植物DNA19

第二节 电泳20

一、琼脂糖凝胶电泳20

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）22

三、脉冲场凝胶电泳（PFGE）24

四、变性梯度凝胶电泳（DGGE）26

五、双向琼脂糖凝胶电泳28

六、碱性琼脂糖凝胶电泳31

七、从琼脂糖凝胶中纯化DNA的方法32

（一）反复冻融法32

（二）利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶上分离 DNA片段32

（三）低熔点琼脂糖纯化法34

第三节 DNA定量分析35

第四节 DNA的酶学操作39

一、DNA限制性内切酶酶切反应39

二、同一反应体系内的DNA双酶切反应40

三、DNA的连接反应41

四、DNA聚合酶和聚合反应42

五、用外切核酸酶Ⅲ产生单向缺失44

六、用磷酸酶使DNA脱磷酸化45

七、用多核苷酸激酶使DNA磷酸化46

八、利用RNA酶处理法制备不含RNA的DNA47

九、用32P或生物素标记DNA探针47

第五节 聚合酶链式反应（PCR）49

一、PCR技术简介49

（一）PCR技术的原理49

（二）影响PCR反应的因素及条件选择50

（三）设计引物应遵循的原则51

二、通过PCR方法扩增一个已知基因51

第六节 DNA克隆53

一、PCR产物的TA克隆53

二、基因组DNA文库的构建55

三、DNA文库的筛选59

四、应用PCR技术快速筛选克隆61

第七节 DNA转化与转染62

一、质粒DNA转化入细菌62

（一）CaC12法感受态大肠杆菌的制备与转化62

（二）利用TSS缓冲液转化大肠杆菌63

（三）用快速冷冻法转化大肠杆菌64

（四）假单孢细菌的转化65

（五）细菌的电击穿孔转化66

二、酵母DNA转化69

（一）原生质体法69

（二）醋酸锂法70

（三）电击穿孔法71

三、农杆菌介导的植物细胞转化73

（一）电穿孔法转染根癌农杆菌73

（二）三亲杂交法转染农杆菌75

（三）烟草叶圆盘与农杆菌共培养获得抗生素抗性小植株77

四、哺乳动物细胞的DNA转染80

（一）磷酸钙法转染哺乳动物细胞80

（二）DEAE-Dextran法转染哺乳动物细胞81

（三）阳离子脂质体介导的转染法转染真核细胞83

（四）辅助方案：转染的甘油处理84

（五）辅助方案：用Hirt氏提取法抽提染色体外游离DNA84

（六）电击穿孔转染技术85

五、反转录病毒介导的基因转移86

第八节 DNA检测与图谱分析89

一、同位素标记Southern杂交89

二、荧光染料标记Southern杂交法93

三、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析96

第九节 基因表达与调控98

一、在大肠杆菌中表达重组蛋白98

二、酵母表达系统101

三、几种新型原核基因融合表达载体107

四、利用杆状病毒在昆虫细胞中进行蛋白表达113

五、外源DNA在蟾蜍卵及胚中的表达118

六、VTF7-3株重组痘苗病毒在哺乳动物细胞中的瞬时表达122

七、反义技术123

第二章 核糖核酸（RNA）130

第一节 创造无RNA酶的环境和凝胶电泳130

一、创造无RNA酶的环境130

二、RNA凝胶电泳131

第二节 RNA的分离133

一、RNA的酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步分离法133

二、使用Trizol Reagent一步法分离RNA135

三、从大肠杆菌中分离RNA136

四、用CsCl超速离心法从动物组织中分离RNA137

五、用Oligo（dT）-纤维素分离Poly（A）＋RNA138

六、从RNA表达载体中制备RNA转录物139

第三节 RNA的检测141

一、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）141

二、竞争性RT-PCR143

三、一步RT-PCR145

四、mRNA的差异显示147

五、原位PCR和杂交——低丰度核酸的检测152

第四节 RNA的杂交检测155

一、Northern杂交155

二、一种快速Northern杂交方法157

三、原位杂交158

第五节 cDNA文库的构建与筛选163

第三章 蛋白质172

第一节 蛋白质的提取与分离172

一、条件培养基的制备172

二、膜蛋白的提取173

三、用于蛋白质检测的细胞裂解物的制备174

第二节 蛋白质电泳175

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳175

二、变性凝胶电泳（SDS-PAGE）178

三、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）181

四、琼脂糖凝胶免疫电泳法测定胎儿甲种球蛋白184

五、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳186

六、凝胶中蛋白质的染色鉴定188

（一）考马斯亮蓝染色法188

（二）银染法189

（三）转印膜上蛋白质的染色191

七、凝胶的干燥192

（一）热真空干燥法192

（二）甘油玻璃纸干燥法192

第三节 蛋白质的鉴定和定量测定193

一、酶联免疫吸附法（ELISA）193

二、免疫沉淀法204

三、蛋白质印迹法205

四、增强化学发光蛋白免疫印迹法207

五、蛋白质配基印迹法208

六、配基和蛋白质间的亲合交联试验法210

第四章 生物芯片技术212

第一节 生物芯片技术原理212

第二节 基因芯片实验流程212

一、芯片微矩阵制备214

二、探针制备及标记217

三、杂交及后处理219

四、检测分析结果219

第三节 蛋白质芯片实验流程222

第五章 计算机技术在分子生物学中的应用224

一、计算机程序在分子生物学中的应用224

二、计算机网络在分子生物学研究中的应用226

（一）文献检索226

（二）分子生物学数据库227

（三）中英文在线生物资源230

（四）网上分子生物学相关杂志233

第六章 分子生物学实验常用参数及资料236

一、分子生物学实验中的常用数据及换算关系236

（一）氨基酸的主要参数236

（二）核苷和脱氧核苷三磷酸的物化常数237

（三）常用单位及换算方法237

（四）常用核酸、蛋白质换算数据237

（五）氨基酸与对应的遗传密码子238

（六）常用DNA分子量参照物238

（七）常用核酸的长度（kb）与其相对分子量的关系239

二、分子生物学实验中的常用试剂及溶液、缓冲液240

（一）常见市售酸碱的浓度240

（二）各种浓度酸碱贮存液的近似pH值240

（三）有机试剂的配制241

（四）细菌培养基和抗生素241

（五）常用缓冲液的配制244

（六）杂交试验中用于降低背景的封闭剂247

（七）常见限制性内切酶酶切位点及缓冲液248

三、与分子生物学实验相关的实验资料249

（一）同位素资料249

（二）与DNA凝胶电泳有关的数据250

（三）离心机转子速度和相对离心力列线圈251

（四）X光底片的冲洗方法252

（五）溴化乙锭溶液的净化处理253

（六）细菌保存254

四、常用仪器使用方法255

（一）恒温箱255

（二）电热恒温水浴256

（三）电动离心机256

（四）722型光栅分光光度计256

（五）751G型分光光度计257

（六）自动部分收集器258

（七）核酸蛋白检测仪259

（八）电子顶载天平260

（九）电子分析天平260

（十）pHS-3C型数字酸度计261

（十一）pHS-2型酸度计261

（十二）移液器的使用262

五、常用实验用品的处理263

（一）玻璃器皿的处理263

（二）硫酸清洁液的配制方法与注意事项263

（三）透析袋的处理263

（四）玻璃器皿的硅化264

六、名词解释264

参考文献268