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1 DNA的制备和分析1

1.1 细菌质粒的制备2

1.1.1 碱裂解法2

1.2.1 酵母细胞质粒DNA的分离3

1.1.2 煮沸法4

1.1.3 小量一步提取法4

1.1.4 DNA制备试剂盒5

1.2 酵母DNA的制备6

1.2.2 酵母染色体DNA的提取8

1.2.3 醋酸锂法转化酵母细胞9

1.2.4 电击转化酵母细胞10

1.3.1 植物细胞核基因组DNA的提取与纯比13

1.3 植物DNA的制备13

1.3.2 植物线粒体基因组DNA的提取18

1.3.3 植物叶绿体基因组DNA的提取21

1.4 cDNA文库入重组DNA的提取25

1.4.1 大量制备λDNA25

1.4.2 小量制备λDNA26

1.5 质粒DNA电镜制样技术27

1.6 植物根尖细胞核染色质层层技术31

1.7 DNA、RNA的定量测定及分析33

1.7.1 紫外吸收法测定核酸含量33

1.7.2 二苯胺显色法测定DNA含量34

1.7.3 地衣酚显色法测定RNA含量35

1.7.4 定磷法测定核酸含量36

2 DNA克隆38

2.1 DNA的酶切41

2.2 DNA片段的纯化回收43

2.2.1 低熔点胶法44

2.2.2 玻璃奶(Giassmilk)法44

2.2.3 DNA回收试剂盒法44

2.2.4 冻融法45

2.3 DNA的重组、转化和蓝白筛选45

2.4 Southern印迹杂交48

2.4.1 同位素标记探针的分子杂文49

2.4.2 DIG标记探针的分子杂交51

2.5 菌落或噬菌斑的原位杂交55

2.6 DNA序列分析57

3 RNA的制备和分析62

3.1 植物组织总RNA的制备63

3.1.1 异硫氰酸胍(GIT)-氯化铯(CsCl)超离心法63

3.1.2 异硫氰酸胍-酚法64

3.1.3 热酚法65

3.2 RNA的定量和完整性分析66

3.2.1 甲醛变性电泳检测RNA完整性66

3.2.2 紫外分光光度计测定RNA含量和纯度67

3.3.1 Oligo(dT)纤维素亲和层析法69

3.3 mRNA的分离和纯化69

3.3.2 磁珠法70

3.4 Northern印迹杂交73

3.5 液体闪烁计测定法80

3.6 转录起始位点的测定82

3.6.1 核酸酶Sl保护分析法82

3.6.2 RNA酶保护分析法85

3.6.3 引物延伸分析法86

3.7 行进转录分析88

4 cDNA文库的构建92

4.1 λZAP+ExpresscDNA文库的构建93

4.1.1 cDNA的合成及修饰95

4.1.3 λ重组DNA的体外包装97

4.1.2 体外重组DNA97

4.1.4 λ噬菌体的转染98

4.1.5 体内剪切98

4.2 扣除文库的构建101

4.2.1 RNA制备103

4.2.2 mRNA的提取103

4.2.3 mRNA样品的DNase I处理104

4.2.4 Tester样品cDNA第一链的合成104

4.2.5 mRNA的水解105

4.2.6 DNA/RNA溶液杂交106

4.3 利用LD—合成cDNA及cDNA文库的构建106

4.2.7 DNA/RNA铰链107

4.2.8 扣除cDNA的克隆107

4.3.1 cDNA的合成112

4.3.2 cDNA文库的构建115

4.3.3 转变λTriplEx2成为TriplEx2质粒117

5 PCR相关技术119

5.1 PCR技术120

5.1.1 基础PCR123

5.1.2 PCR产物的TA克隆126

5.1.3 原位PCR132

5.1.4 PCR法筛选cDNA文库136

5.1.5 再生式序列复制反应(3SR)139

5.1.6 PCR快速扩增(RACE)获得全长cDNA141

5.2 应用PCR技术克隆未知基因145

5.2.1 反转录(RT)-PCR150

5.2.2 差别显示反转录(DDRT)-PCR155

5.2.3 RNA的任意引物(RAP) -PCR163

5.3 分子标记技术164

5.3.1 DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析166

5.3.2 随机扩增多态性(RAPD)分析168

5.3.3 微卫星DNA多态性分析171

6.1.1 离体器官直接再生不定芽的培养174

6.1 植物组织培养再生体系的建立174

6 基因表达与调控研究技术174

6.1.2 愈伤组织培养175

6.2 植物遗传转化体系的建立176

6.2.1 农杆菌介导的转化177

6.2.2 基因枪转化技术179

6.2.3 电激转化技术184

6.2.4 转基因植株的鉴定185

6.2.5 外源目标基因在转基因植株中的表达185

6.3 Southwestern法筛选转录因子cDNA的克隆186

6.4 一步杂交法克隆DNA结合蛋白的cDNA189

6.5.2 突变型(auxotroph)细胞的转化193

6.6 真核细胞的基因在大肠杆菌中的表达193

6.5 异源互补法筛选低丰度的基因193

6.5.1 cDNA表达文库的构建193

6.7 体外转录和翻译偶联检测法197

6.8 凝胶阻滞分析203

7 蛋白质的分离与分析206

7.1 蛋白质的电泳技术206

7.1.1 聚丙烯酰眩凝胶-等电聚焦电泳206

7.1.2 蛋白质的双向电泳技术208

7.1.3 高效毛细管电泳212

7.2 植物同工酶电泳分析技术217

7.3.1 免疫血清的制备220

7.3 免疫分析技术220

7.3.2 酶联免疫吸附测定224

7.3.3 双向免疫扩散技术—-—平板法227

7.4 薄层层析技术分离分析氨基酸230

7.5 Western—印迹杂交235

8 细胞生物学常用技术243

8.1 植物细胞质膜的分离和纯化技术243

8.2 植物细胞器标记酶的测定248

8.3 植物细胞、组织或器官氧化还原活性的测定250

8.4 植物原生质体的培养252

8.5 植物组织中几种酶的组织化学定位鉴定255

8.6 植物激素的提取和鉴定259

8.7 放射免疫分析法测定几种激素261

8.7.1 血清或血浆孕酮放射免疫测定法261

8.7.2 组织中cAMP测定法(蛋白结合法)263

8.7.3 血清雌二醇(Estradi01)的测定265

8.7.4 人绒毛膜促性腺激素(HCG)的放免测定266

8.8 显微摄影技269

8.8.1 显微摄影装置269

8.8.2 感光片的选择与应用270

8.8.3 滤光镜的作用271

8.8.4 黑白底片的冲洗271

8.8.5 黑白照片放大272

9.1 国际互联网(Internet)的应用概述273

9 计算机技术在分子生物学中的应用273

9.2 序列分析软件275

9.3 引物评价的计算机软件278

9.4 序列数据向数据库的传送280

9.5 常用数据库及其软件282

9.5.1 BLAST程序家族所适用的范围282

9.5.2 用于BLAST程序的数据库282

9.5.3 用于分子生物学的免费分析软件283

9.5.4 分子生物学中常用的数据库284

9.5.5 Internet上的生物学杂志及其网址286

9.5.6 常用的分子生物学网址287

1.2 常用核酸与蛋白质换算数据289

1.3 DNA在溶液中的浓度290

附录2 酶类291

2.2 蛋白水解酶291

2.1 溶菌酶291

2.3 无DNA酶的RNA酶291

3.1 常用缓冲液292

3.2 电泳缓冲液292

附录3 缓冲液292

3.3 常用的凝胶加样缓冲液293

3.4 测序凝胶加样缓冲液294

附录4 与DNA凝胶电泳有关的数据295

4.1 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的分辨范围295

4.2 聚丙烯酰胺凝胶浓度与线性DNA的分辨范围295

4.3 染料在非变性聚丙烯酰胺疑胶中的迁移速度295

4.4 染料在变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度296

附录5 细菌培养基和抗生素296

5.1 液体培养基296

5.3 保存培养基298

5.2 含有琼脂或琼脂糖的培养基298

5.5 用于噬菌体操作的溶液299

5.4 抗生素299

1.1 常用核酸的长度与分子量299

附录299

附录1 有关核酸的常用数据299

附录6 杂交实验中用于降低背景的封闭剂300

6.1 Denhardt试剂300

6.2 BLOTTO301

6.3 肝素301

6.4 经变性并被打断的鲑精DNA301

附录7 分子生物学有毒试剂的净化处理和安全使用301

附录8 图表目录303

附录9 人类遗传疾病在染色体上的定位307

附录10 酵母遗传学命名法328

附录11 缩略语表329