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第1章 绪论1

1.1历史背景1

1.2组织培养的优点7

1.2.1环境控制7

1.2.2样品的特征和均一性8

1.2.3经济、规模和机械化8

1.2.4体内环境的体外模拟8

1.3局限性9

1.3.1专业技能9

1.3.2量的问题9

1.3.3去分化和选择10

1.3.4细胞的起源10

1.3.5不稳定性10

1.4体外的主要差异10

1.5组织培养的类型11

第2章 培养细胞的生物学14

2.1培养细胞的环境14

2.2细胞黏附14

2.2.1细胞黏附分子15

2.2.2细胞间连接16

2.2.3细胞外基质16

2.2.4细胞骨架18

2.2.5细胞迁移18

2.3细胞增殖18

2.3.1细胞周期18

2.3.2细胞增殖的调控19

2.4细胞分化20

2.4.1细胞分化的维持21

2.4.2细胞去分化21

2.5细胞信号传递24

2.6能量代谢25

2.7培养细胞的起源26

2.7.1培养的开始26

2.7.2细胞系的演化27

2.7.3细胞的衰老28

2.7.4连续细胞系的转化与形成28

第3章 实验室设计、布局及设备30

3.1布局、规划和服务设施30

3.1.1要求32

3.1.2服务设施34

3.1.3通风装置35

3.2布局35

3.2.1无菌操作区36

3.2.2层流原理36

3.2.3工作台36

3.2.4检疫室和防范室36

3.2.5培养37

3.2.6准备区40

3.2.7储存41

第4章 设备及材料44

4.1组织培养实验室的要求44

4.2无菌区46

4.2.1洁净台46

4.2.2手推车48

4.2.3无菌液操作——移液和分装49

4.2.4倒置显微镜53

4.2.5CCD摄像机和监视器54

4.2.6解剖显微镜54

4.2.7离心机54

4.2.8细胞计数55

4.3细胞孵育和培养55

4.3.1恒温箱55

4.3.2湿式CO2培养箱56

4.3.3温度记录仪57

4.3.4滚动架57

4.3.5磁力搅拌器58

4.3.6培养器皿58

4.4实验准备和杀菌58

4.4.1清洗58

4.4.2培养基和试剂的制备59

4.4.3杀菌61

4.5储存63

4.5.1消耗品63

4.5.2冰箱和冷冻箱63

4.5.3冷藏器64

4.5.4可控速率冷冻箱64

4.6附属设备64

4.6.1计算机和网络64

4.6.2普通正置显微镜65

4.6.3低温冷冻箱65

4.6.4共聚焦显微镜65

4.6.5PCR循环仪65

4.7专用设备66

4.7.1显微注射装置66

4.7.2集落计数器66

4.7.3可离心淘洗机66

4.7.4流式细胞仪66

第5章 无菌技术67

5.1无菌技术的目标67

5.1.1微生物污染的风险67

5.1.2无菌的维持67

5.2创造无菌环境的各种因素68

5.2.1层流69

5.2.2安静的工作区域71

5.2.3工作面71

5.2.4个人卫生73

5.2.5试剂和培养基73

5.2.6培养物73

5.3灭菌操作73

5.3.1擦拭73

5.3.2加盖74

5.3.3灼烧74

5.3.4试剂瓶和培养瓶的操作74

5.3.5移液75

5.3.6液体倾倒75

5.4标准操作程序76

5.5仪器和设备82

5.5.1培养箱82

5.5.2盒装培养物82

5.5.3充入CO2气体82

第6章 安全性、生物伦理及验证83

6.1实验室安全83

6.2危险性评估83

6.3标准操作程序85

6.4安全规则85

6.5常规安全86

6.5.1操作者87

6.5.2设备87

6.5.3玻璃器皿和锐利物品87

6.5.4化学毒性88

6.5.5气体89

6.5.6液氮89

6.5.7灼烧90

6.6火90

6.7放射性91

6.7.1摄入91

6.7.2放射性废弃物的处理91

6.7.3标记的试剂91

6.7.4高能源91

6.8生物危害性92

6.8.1生物防范水平92

6.8.2微生物学安全通风橱（MSC）94

6.8.3人体活检材料96

6.8.4遗传操作97

6.8.5生物危害性废弃物处理97

6.8.6熏蒸97

6.9生物伦理98

6.9.1动物组织98

6.9.2人体组织材料98

6.10质量保证99

6.10.1操作程序100

6.10.2质量控制（QC）100

6.11验证100

6.11.1鉴定100

6.11.2来源101

6.11.3污染101

第7章 培养器皿和附着物102

7.1附着物102

7.1.1细胞的附着和生长102

7.1.2常见的附着材料102

7.1.3其他替代性附着物103

7.2表面处理103

7.2.1基质覆盖103

7.2.2饲养层105

7.2.3非黏附性附着面106

7.3培养器皿的选择107

7.3.1细胞产量107

7.3.2悬浮培养109

7.3.3通风110

7.3.4取样和分析111

7.3.5不均匀生长112

7.3.6价格112

7.4特殊系统112

7.4.1渗透性支持物112

7.4.2三维基质113

第8章 成分明确培养基及补充物115

8.1培养基的发展史115

8.2物理化学特征115

8.2.1pH115

8.2.2CO2和碳酸盐116

8.2.3缓冲作用123

8.2.4氧气123

8.2.5渗透压124

8.2.6温度124

8.2.7黏滞度125

8.2.8表面张力和成泡性125

8.3平衡盐溶液126

8.4完全培养基126

8.4.1氨基酸127

8.4.2维生素127

8.4.3盐类127

8.4.4葡萄糖128

8.4.5有机补充物128

8.4.6激素和生长因子128

8.4.7抗生素128

8.5血清129

8.5.1蛋白质130

8.5.2生长因子131

8.5.3激素131

8.5.4营养物及代谢物132

8.5.5脂类132

8.5.6矿物质132

8.5.7抑制物132

8.6培养基和血清的选择132

8.6.1批次预约134

8.6.2血清的测试135

8.6.3热灭活135

8.7其他添加物136

8.7.1氨基酸水解物136

8.7.2胚胎浸出液136

8.7.3适应性培养基136

第9章 无血清培养基137

9.1血清的缺点145

9.2无血清培养基的优点146

9.2.1标准培养基的定义146

9.2.2选择性培养基146

9.2.3调节细胞增殖与分化146

9.3无血清培养基的缺点146

9.4血清的替代147

9.4.1无血清培养基的商业供应147

9.4.2血清替代物147

9.4.3无血清传代培养148

9.4.4激素149

9.4.5生长因子149

9.4.6血清中的营养物质154

9.4.7蛋白质和多聚胺154

9.4.8黏滞度154

9.5无血清培养基的选择154

9.5.1细胞或产物特异性154

9.5.2适应无血清培养基157

9.6无血清培养基的研发157

9.7无血清培养基的制备157

9.8无动物蛋白培养基158

9.9小结158

第10章 准备与灭菌159

10.1准备试剂与用品159

10.2设备与液体的灭菌159

10.3设备162

10.3.1玻璃器皿162

10.3.2玻璃移液管165

10.3.3螺口盖168

10.3.4清洁剂的选择170

10.3.5种类繁杂的设备170

10.3.6可重复使用的灭菌过滤器171

10.4试剂与培养基173

10.4.1水173

10.4.2纯水器的维护175

10.4.3平衡盐溶液175

10.4.4培养基的配制与灭菌177

10.4.5干粉培养基180

10.4.6特制培养基182

10.5培养基的灭菌183

10.5.1可高压灭菌的培养基183

10.5.2除菌过滤183

10.5.3血清192

10.5.4其他试剂的准备与灭菌195

10.6培养基的质控、检测和储存196

10.6.1质量控制196

10.6.2无菌检测196

10.6.3培养物检测197

10.6.4储存197

第11章 原代培养199

11.1原代培养入门199

11.1.1用于解离组织的酶199

11.1.2解离过程的共同特点200

11.2组织分离200

11.2.1小鼠胚胎200

11.2.2鸡胚204

11.2.3人体活检材料206

11.3原代培养的类型207

11.3.1原代外植207

11.3.2酶的解离作用210

11.3.3温胰蛋白酶消化210

11.3.4低温预处理的胰蛋白酶消化213

11.3.5鸡胚器官原基216

11.3.6其他酶解过程219

11.3.7胶原酶220

11.3.8机械法解离222

11.3.9分离活细胞224

11.3.10原代培养小结225

11.3.11原始记录225

第12章 传代培养和细胞系227

12.1传代培养和扩增227

12.1.1交叉污染和鉴定错误229

12.1.2支原体污染231

12.1.3术语定义231

12.1.4细胞系的命名232

12.1.5培养物的年龄233

12.2选择细胞系233

12.3常规培养234

12.3.1细胞形态的意义234

12.3.2培养基的更换235

12.3.3标准的换液方案236

12.4传代238

12.4.1传代标准240

12.4.2单层生长细胞典型的传代方案241

12.4.3生长周期和传代比率243

12.4.4传代时的细胞浓度245

12.4.5悬浮培养细胞的扩增245

12.4.6悬浮生长细胞的传代246

12.4.7培养条件的标准化248

12.4.8抗生素的使用248

12.4.9培养记录249

第13章 克隆培养及筛选251

13.1克隆培养251

13.2贴壁率的刺激255

13.2.1促进克隆生长的条件255

13.2.2条件培养基256

13.2.3饲养层细胞257

13.3悬浮克隆培养259

13.4细胞克隆的分离264

13.4.1单层贴壁细胞克隆的其他分离技术267

13.4.2悬浮细胞克隆268

13.5复制性培养269

13.6选择性抑制剂269

13.7遗传变异细胞的筛选270

13.8细胞与基质的相互作用272

13.8.1选择性黏附272

13.8.2选择性脱壁272

13.8.3基质性质273

13.8.4选择性饲养层273

13.8.5半固体培养基选择273

第14章 细胞分离275

14.1细胞密度及等密度沉降法275

14.2细胞体积与沉降速率279

14.2.1单位重力沉降279

14.2.2离心淘洗分离技术279

14.3以抗体为基础的分离技术280

14.3.1免疫盘化法281

14.3.2免疫磁珠分选281

14.4荧光活化的细胞分选法284

14.5其他分离技术285

14.6初学者如何进行细胞分离实践286

第15章 细胞鉴定287

15.1鉴定的需求287

15.2真实性验证287

15.3保存记录和身世288

15.4鉴定指标288

15.4.1种属鉴定289

15.4.2谱系或组织标记289

15.4.3独特标记物291

15.4.4转化291

15.5细胞形态学291

15.5.1显微镜使用295

15.5.2染色297

15.5.3细胞学检查所用培养器皿：单层培养299

15.5.4悬浮细胞细胞学检查标本的制备299

15.5.5光学显微照相技术302

15.6共聚焦显微镜303

15.7染色体分析303

15.7.1染色体显带技术306

15.7.2染色体分析307

15.8DNA含量308

15.8.1DNA杂交308

15.8.2DNA指纹技术308

15.8.3DNA绘谱309

15.9RNA和蛋白质314

15.10酶活性314

15.10.1同工酶314

15.10.2利用Authentikit进行同工酶电泳315

15.11抗原标记318

15.11.1免疫染色320

15.11.2免疫分析321

15.12分化322

第16章 分化323

16.1体内表型的表达323

16.1.1去分化323

16.1.2细胞谱系选择324

16.2分化阶段324

16.3增殖和分化324

16.4定向和细胞谱系325

16.5干细胞可塑性326

16.6分化标记物327

16.7诱导分化328

16.7.1细胞相互作用328

16.7.2全身性因子330

16.7.3细胞-基质相互作用333

16.7.4极性和细胞形状334

16.7.5氧张力334

16.8分化和恶性334

16.9应用334

第17章 转化和永生化336

17.1在细胞系鉴定中的作用337

17.2什么是转化337

17.3遗传不稳定性和异质性338

17.3.1遗传不稳定性338

17.3.2染色体畸变339

17.4永生化339

17.4.1衰老的控制340

17.4.2病毒基因致永生化341

17.4.3人成纤维细胞的永生化342

17.4.4端粒酶诱导的永生化345

17.4.5淋巴细胞永生化350

17.4.6转基因鼠350

17.5生长控制异常350

17.5.1停泊不依赖性350

17.5.2接触抑制351

17.5.3血清依赖353

17.5.4癌基因354

17.6致瘤性354

17.6.1恶性化354

17.6.2肿瘤移植355

17.6.3侵袭力355

17.6.4血管发生356

17.6.5纤溶酶原活化因子359

第18章 污染361

18.1污染的来源361

18.1.1操作者的技术363

18.1.2环境364

18.1.3层流通风橱的使用和维护364

18.1.4湿度恒温箱364

18.1.5冷藏库365

18.1.6无菌材料366

18.1.7引入的细胞系和活组织366

18.1.8隔离366

18.2微生物污染的种类366

18.3污染物的监控366

18.3.1可见的微生物污染367

18.3.2支原体368

18.3.3支原体的荧光染色369

18.3.4PCR法检测支原体370

18.3.5检测支原体的替代方法374

18.3.6支原体检测服务375

18.3.7病毒污染375

18.4污染培养物的处理375

18.5污染的去除376

18.5.1细菌、真菌和酵母菌376

18.5.2支原体的消除377

18.5.3清除病毒污染378

18.5.4顽固污染379

18.6交叉污染379

18.7结论380

第19章 冻存381

19.1冻存的意义381

19.2冻存前注意事项381

19.2.1鉴定382

19.2.2何时冻存382

19.3冻存细则382

19.3.1细胞冻存的理论背景382

19.3.2细胞浓度382

19.3.3冻存液383

19.3.4冷却速度383

19.3.5安瓿386

19.3.6低温冰箱386

19.3.7培养细胞的冻存389

19.3.8冻存记录391

19.3.9安瓿的解冻392

19.3.10培养瓶冻存394

19.4玻璃化保存394

19.4.1hES细胞的冻存394

19.4.2hES细胞解冻397

19.5冻存库的设计和监控398

19.5.1冻存管理399

19.5.2细胞库存的连续更换399

19.6细胞库400

19.7细胞的运输400

19.7.1冻存安瓿401

19.7.2活细胞401

第20章 定量403

20.1细胞计数403

20.1.1血细胞计数器404

20.1.2电子计数407

20.1.3染色的单层细胞411

20.1.4流式细胞仪411

20.2细胞质量413

20.3DNA含量413

20.4蛋白质414

20.4.1样品的溶解性414

20.4.2Bradford分析414

20.5合成速率415

20.5.1DNA合成415

20.5.2蛋白质合成417

20.6准备样品用于酶分析和免疫分析418

20.7细胞计数419

20.7.1原位标记419

20.7.2流式细胞术419

20.8重复取样419

20.8.1数据获得419

20.8.2数据分析420

20.9细胞增殖420

20.9.1实验设计421

20.9.2生长周期421

20.9.3单层细胞生长曲线的分析425

20.9.4培养基体积，细胞浓度和细胞密度427

20.9.5悬浮培养428

20.9.6生长周期的各个阶段429

20.9.7生长曲线的衍生物430

20.10贴壁效率431

20.10.1集落形成分析433

20.10.2自动集落计数434

20.11标记指数434

20.11.1生长分数437

20.11.2有丝分裂指数438

20.11.3分裂指数438

20.12细胞周期时间438

20.13细胞迁移438

第21章 细胞毒性439

21.1活性、毒性和存活439

21.2体外局限性440

21.2.1药物代谢动力学440

21.2.2新陈代谢440

21.2.3组织和全身反应440

21.3分析的性质440

21.3.1生存力441

21.3.2存活443

21.3.3细胞增殖测定448

21.3.4代谢性细胞毒性测定448

21.3.5微滴定实验449

21.3.6微滴定与克隆存活的比较453

21.3.7药物的相互作用454

21.4细胞毒性实验的应用454

21.4.1抗癌药物筛选454

21.4.2肿瘤药物的前瞻性实验454

21.4.3药物学实验455

21.5基因毒性455

21.5.1姐妹染色单体交换的诱变实验455

21.5.2致癌性458

21.6炎症反应459

第22章 特殊类型细胞的培养461

22.1特殊细胞培养技术463

22.2上皮细胞463

22.2.1表皮464

22.2.2角膜469

22.2.3乳腺471

22.2.4子宫颈473

22.2.5胃肠道476

22.2.6肝478

22.2.7原代肝细胞培养478

22.2.8人肝癌细胞系HepaRG481

22.2.9胰483

22.2.10肾485

22.2.11气管和支气管上皮487

22.2.12口腔上皮489

22.2.13前列腺490

22.3间充质细胞492

22.3.1结缔组织493

22.3.2脂肪组织493

22.3.3肌495

22.3.4软骨501

22.3.5骨504

22.3.6内皮细胞506

22.4神经外胚层细胞512

22.4.1神经细胞512

22.4.2神经胶质细胞513

22.4.3内分泌细胞519

22.4.4黑素细胞520

22.5造血细胞523

22.6生殖腺524

22.6.1卵巢524

22.6.2睾丸524

第23章 干细胞、生殖细胞和羊水细胞525

23.1干细胞525

23.1.1胚胎干细胞525

23.1.2小鼠胚胎干细胞的诱导525

23.1.3小鼠胚胎干细胞的传代培养和扩增530

23.1.4人胚胎干细胞的原代培养532

23.1.5hES细胞的传代534

23.1.6鱼胚胎来源的多能干细胞535

23.2生殖细胞539

23.3胚外细胞540

23.3.1羊水细胞的培养540

23.3.2从新生儿或青年来源的细胞544

23.3.3成人来源的多能干细胞544

23.3.4人骨髓来源间充质干细胞545

23.3.5诱导多潜能干细胞548

23.3.6小鼠骨髓长期培养552

23.3.7人原始造血细胞长期培养554

23.3.8造血细胞集落形成分析559

第24章 肿瘤细胞培养562

24.1肿瘤细胞培养中的问题562

24.2取材563

24.2.1代表性细胞的选择563

24.2.2冷冻组织保存564

24.3分离564

24.4原代培养565

24.5肿瘤细胞的选择培养566

24.5.1选择培养基566

24.5.2汇合饲养层566

24.5.3悬浮克隆569

24.5.4异种移植569

24.6细胞系的建立570

24.6.1原代肿瘤培养物的传代570

24.6.2连续细胞系570

24.7肿瘤细胞培养物的特征571

24.7.1肿瘤细胞的异质性571

24.7.2组织型培养572

24.8特殊类型肿瘤572

24.8.1乳腺572

24.8.2肺574

24.8.3胃575

24.8.4结肠575

24.8.5胰腺578

24.8.6卵巢578

24.8.7前列腺578

24.8.8膀胱579

24.8.9皮肤579

24.8.10子宫颈580

24.8.11胶质细胞瘤580

24.8.12神经母细胞瘤581

24.8.13精原细胞瘤581

24.8.14淋巴瘤和白血病581

第25章 三维培养583

25.1细胞的相互作用和表型表达583

25.1.1细胞密度的作用583

25.1.2相互作用584

25.1.3模型的选择584

25.2器官培养586

25.2.1气体和营养物质的交换586

25.2.2结构的完整性586

25.2.3生长与分化587

25.2.4器官培养的限制587

25.2.5器官培养的类型587

25.3组织型培养589

25.3.1凝胶和海绵技术589

25.3.2中空纤维590

25.3.3球体590

25.3.4转动室系统593

25.3.5藻酸盐活细胞固定术594

25.3.6滤膜培养皿594

25.3.7神经聚集物的培养597

25.4器官型培养599

25.4.1组织等同物599

25.4.2组织工程599

25.5三维构建物中细胞的成像601

第26章 规模与自动化602

26.1悬浮规模培养602

26.1.1连续培养605

26.1.2规模和复杂性606

26.1.3搅匀和换气608

26.2单层规模培养610

26.2.1多表面扩增器610

26.2.2旋转培养613

26.2.3微载体615

26.2.4巨型微载体617

26.2.5灌流式单层培养619

26.3程序控制620

26.4自动化621

26.4.1机器人细胞培养621

26.4.2高产量检测622

第27章 特殊技术624

27.1淋巴细胞的制备624

27.1.1隔离的密度624

27.1.2淋巴母细胞的转化625

27.2放射自显影术626

27.3间隔性记录632

27.4细胞同步化634

27.4.1细胞分离634

27.4.2阻断635

27.5冷血动物细胞的培养635

27.5.1鱼细胞636

27.5.2昆虫细胞636

27.6体细胞融合637

27.6.1细胞杂交637

27.6.2移核实验640

27.7单克隆抗体的制备640

第28章 培训纲要646

28.1目的646

28.2实验制备及操作技巧647

28.3基本的细胞培养技术660

28.4高阶练习682

28.5特殊练习697

第29章 问题与对策698

29.1细胞异常形态698

29.2细胞生长缓慢699

29.2.1仅限于自己细胞出了问题699

29.2.2其他人也遇到同样的问题699

29.3培养基700

29.3.1试剂配方、准备和存储700

29.3.2不稳定试剂701

29.3.3配制培养基各种成分的纯度702

29.4基质和容器703

29.5微生物污染703

29.5.1仅限于单个实验者的问题704

29.5.2普遍问题705

29.5.3室内供气和层流净化工作台706

29.5.4特定污染706

29.6化学污染707

29.6.1玻璃器皿707

29.6.2移液管707

29.6.3水的纯化707

29.6.4低温冻存707

29.6.5粉末或气溶胶708

29.7原代培养708

29.7.1原代培养的存活率低708

29.7.2选择细胞错误709

29.7.3污染709

29.8分化710

29.9饲养层710

29.9.1常规单层培养710

29.9.2克隆培养710

29.10传代711

29.10.1收获率低或生长缓慢711

29.10.2生长不均匀711

29.11克隆712

29.11.1培养皿形成的克隆数过低712

29.11.2培养皿形成的克隆数太多713

29.11.3非随机分布713

29.12交叉污染和错误标记713

29.13冻存714

29.13.1复苏时存活率低714

29.13.2冻存后细胞形态发生变化714

29.13.3冻存细胞丢失715

29.14细胞计数715

29.14.1血细胞计数板715

29.14.2使用电阻抗法电子计数仪715

第30章 结语717

附录Ⅰ计算配制及试剂制备719

附录Ⅱ设备及材料来源733

附录Ⅲ供应商和其他资源763

附录Ⅳ术语779

附录Ⅴ交叉污染或鉴定有误的细胞系789

附录Ⅵ一般教材与相关期刊809

参考文献811

索引883