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第一章 绪论1

1.1 蛋白折叠液相色谱法的定义1

1.2 蛋白折叠液相色谱法的特色2

1.3 发展史3

1.4 本书的内容6

参考文献8

第二章 蛋白质的结构与构象变化9

2.1 概述9

2.2 蛋白质分子的化学结构10

2.3 蛋白质分子的空间结构12

2.3.1 蛋白质二级结构13

2.3.2 超二级结构16

2.3.3 结构域17

2.3.4 三级结构17

2.3.5 四级结构19

2.4 稳定蛋白质分子构象的作用力19

2.5 蛋白质分子构象的研究方法22

2.5.1 X射线衍射结构分析法22

2.5.2 圆二色性光谱法23

2.5.3 紫外差示光谱法24

2.5.4 荧光光谱法25

2.5.5 激光拉曼光谱法26

2.5.6 氢同位素交换法26

2.5.7 核磁共振法26

参考文献28

第三章 液相色谱对生物大分子构象变化的表征29

3.1 概述29

3.2 液相色谱中的计量置换保留理论30

3.3 Z和lgI对生物大分子构象变化的表征37

3.4 RPLC中Z和lgI对生物大分子构象变化的表征39

3.4.1 Z值与蛋白质相对分子质量39

3.4.2 蛋白质构象的始末状态40

3.4.3 RPLC中甲酸浓度与生物大分子的构象变化41

3.4.4 Z值与离子对试剂42

3.4.5 蛋白质热变性的表征43

3.4.6 RPLC中Z对白细胞介素-2突变蛋白分子的构象变化的表征45

3.4.7 不同变性态条件下Lys的构象表征48

3.4.8 在RPLC中人工交联修饰蛋白保留行为及其Z和lgI值的表征51

3.4.9 重组人干扰素-γ在有孔与无孔反相硅胶固定相上保留行为的比较52

3.5 HIC中蛋白分子构象的Z表征53

3.5.1 HIC中在变性剂存在条件下Z值的准确测定方法54

3.5.2 脲浓度与蛋白质分子构象变化的Z表征57

3.5.3 胍浓度与蛋白质分子构象变化的Z表征58

3.5.4 Z和1gI值的测定精度60

3.6 离子交换色谱中蛋白分子构象Z和lgI的表征62

3.6.1 IEC中变性蛋白与Z和lgI值的测定62

3.6.2 不同变性状态下Lys的弱阳离子交换色谱保留63

3.6.3 不同脲浓度下Lys与Z值65

3.6.4 Z对还原变性Lys活性回收率随脲浓度变化趋势66

3.6.5 Z对Lys分子构象变化的定量表征67

3.6.6 lgI对Lys分子构象变化的定量表征67

3.6.7 不同构象Lys分子与固定相的亲和力68

参考文献68

第四章 蛋白折叠70

4.1 概述70

4.2 包涵体71

4.2.1 包涵体的特性及其形成原因71

4.2.2 包涵体蛋白质的生产程序72

4.2.3 包涵体的分离和纯化73

4.2.4 包涵体的溶解73

4.2.5 包涵体蛋白的复性74

4.2.6 蛋白折叠的发展近况74

4.3 蛋白质的变性76

4.4 蛋白质的失活78

4.5 蛋白折叠中间体的研究79

4.6 蛋白折叠机理81

4.6.1 热力学模型82

4.6.2 动力学模型83

4.6.3 蛋白多肽链折叠的模型介绍84

4.7 蛋白质的复性方法90

4.7.1 稀释法91

4.7.2 透析法93

4.7.3 超滤法94

4.7.4 新发展的复性方法94

参考文献118

第五章 液相色谱法对变性蛋白的折叠126

5.1 概述126

5.2 各种LC复性的热力学基础-化学平衡127

5.3 排阻色谱129

5.3.1 SEC复性的原理130

5.3.2 SEC复性的影响因素131

5.3.3 SEC复性方法的改进133

5.3.4 SEC复性法的应用137

5.3.5 重组人粒细胞集落刺激因子的SEC复性138

5.4 离子交换色谱144

5.4.1 用弱阳离子交换色谱法复性溶菌酶154

5.4.2 用强阴离子交换色谱法（SAX）复性并同时纯化rhG-CSF158

5.5 亲和色谱161

5.6 疏水相互作用色谱167

5.7 各种LC复性方法的比较169

5.8 HPHIC对变性蛋白的折叠与复性举例170

5.8.1 HPHIC对非还原变性蛋白的复性170

5.8.2 HPHIC对还原变性牛胰岛素的折叠170

5.8.3 HPHIC纯化并同时复性E.coli表达的重组牛朊病毒正常蛋白片断173

5.8.4 HPHIC对还原变性溶菌酶的复性175

5.9 HPHIC进行蛋白折叠的分子学机理177

5.9.1 变性蛋白在HPHIC固定相上的吸附及微区的形成——固定相对蛋白折叠的贡献177

5.9.2 流动相对蛋白折叠的贡献179

5.9.3 HPHIC固定相和流动相的协同作用在蛋白折叠过程中的作用179

5.9.4 HPHIC法折叠蛋白与“人工分子伴侣”182

5.10 影响HPHIC对蛋白复性的因素182

5.10.1 固定相183

5.10.2 流动相184

5.10.3 色谱条件187

5.11 用LC法对蛋白复性的展望191

参考文献192

第六章 液-固界面上变性蛋白折叠自由能的测定197

6.1 概述197

6.2 液-固界面上蛋白折叠自由能测定的理论基础198

6.3 蛋白折叠自由能的测定201

6.3.1 不同浓度变性剂存在下蛋白质的lgI和Z值201

6.3.2 液-固界面上蛋白折叠自由能的测定204

6.4 蛋白折叠途径中能垒与能阱207

6.4.1 能垒和能阱的定义207

6.4.2 蛋白折叠途径中的能量表征209

6.4.3 蛋白活性与△△GF210

参考文献212

第七章 变性蛋白复性与同时纯化装置214

7.1 概述214

7.2 短柱理论215

7.2.1 短柱理论表达式的推导216

7.2.2 短柱对生物大分子的分离效果218

7.3 色谱饼——变性蛋白复性与同时纯化装置218

7.3.1 色谱饼的性能220

7.3.2 不同规格色谱饼对标准蛋白的色谱分离223

7.4 色谱饼用于蛋白复性与同时纯化223

7.4.1 色谱饼对核糖核酸酶A和溶菌酶的复性及同时分离224

7.4.2 人血清白蛋白的快速纯化224

7.4.3 用色谱饼纯化蛋清中溶菌酶225

7.5 快速蛋白纯化色谱柱227

7.5.1 快速蛋白纯化柱的形状及结构228

7.5.2 色谱柱的柱压229

7.5.3 疏水型快速蛋白纯化柱对标准蛋白的分离229

7.5.4 离子交换型快速蛋白纯化柱对标准蛋白的分离231

7.5.5 柱寿命的测定232

7.5.6 快速蛋白纯化柱质量负载的测定233

7.6 应用举例234

7.6.1 疏水型快速蛋白纯化柱对变性溶菌酶的复性234

7.6.2 快速蛋白纯化柱对猪心中细胞色素c的纯化236

7.6.3 快速蛋白纯化柱对粗α-淀粉酶的纯化238

7.6.4 疏水型快速蛋白纯化柱对重组人干扰素-γ的复性与同时纯化241

7.7 蛋白质复性及同时纯化的策略244

7.7.1 用HIC复性蛋白的一般策略244

7.7.2 用IEC复性蛋白的一般策略245

参考文献246

第八章 重组蛋白药物的复性与同时纯化及其工业化生产举例248

8.1 概述248

8.2 重组蛋白药物的复性与同时纯化249

8.2.1 蛋白质复性及同时纯化装置对IL-2-Ang复性249

8.2.2 重组人胰岛素原的复性及同时纯化250

8.2.3 对某大学重组蛋白样品的纯化250

8.2.4 蛋白质复性及同时纯化装置对rhG-CSF复性251

8.2.5 重组人干细胞因子的复性并同时纯化253

8.2.6 SAX型快速蛋白纯化柱对重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）的复性并同时纯化254

8.2.7 在工业上用疏水相互作用色谱复性和纯化干扰素-γ258

8.2.8 膨胀床色谱用于蛋白复性266

8.2.9 模拟移动床用于蛋白复性268

8.2.10 连续环状色谱复性270

参考文献272

第九章 典型实验274

9.1 色谱饼的使用274

9.2 科林快速蛋白纯化柱的测试275

9.3 实验一科林快速蛋白纯化柱柱效的检测277

9.4 实验二科林快速蛋白纯化柱对猪心中细胞色素c的分离与纯化280

9.5 实验三 科林快速蛋白纯化柱对变性溶菌酶和核糖核酸酶复性与同时纯化283

9.6 实验四科林快速蛋白纯化柱对重组人干扰素-γ的复性及同时纯化285

9.7 实验五色谱饼对标准蛋白分离性能的检测288

9.8 实验六科林快速蛋白纯化柱对还原变性溶菌酶的复性290