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引言（陈忠斌译）1

1植物中的正义共抑制：历史、现状与展望（陈忠斌王艳华译崔洪志校）4

1.1植物基于同源性基因沉默机制的早期认识5

1.2RNA复制和其中RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）6

1.3过量表达正义转基因引起RNA沉默的两种模型7

1.3.1dsRNA转录体触发RNA沉默8

1.3.2单拷贝正义外源基因如何成为RNA沉默的触发分子8

1.3.3解释植物共抑制相关文献的复杂性10

1.4基因翻译在正义共抑制中的作用？11

1.5DNA甲基化与RNA沉默的关系13

1.6正义共抑制在植物生理和发育中的潜在作用14

1.6.1RNA沉默信号和功能性内源mRNA通过胞间连丝在细胞间运输14

和通过韧皮部长距离转移14

1.6.2正义共抑制表型中的表遗传（epigenetic）变化14

1.6.3植物中超细胞（supracellular）信息加工和存贮的可能假说17

致谢17

参考文献18

2动物细胞中的转基因共抑制（梅柱中译陈忠斌校）21

2.1果蝇转基因沉默现象22

2.1.1其他构件引起的共抑制23

2.1.2聚合梳族基因的影响24

2.1.3含PRE元件构件间的相互作用26

2.1.4共抑制和配对敏感性沉默26

2.2果蝇转基因的转录后沉默28

2.3Run-On转录分析30

2.4piwi与aubergine对转录后及转录水平基因沉默的影响30

2.5转基因对转座元件的影响33

2.6果蝇中Stellate/Stellate抑制子的相互作用34

2.7线虫基因表达共抑制34

2.8哺乳动物中的共抑制35

2.9总结36

致谢37

参考文献38

3双链RNA对基因组的调控（付汉江译杨明郑晓飞校）43

3.1RNA介导的DNA甲基化44

3.3RNA介导的启动子序列甲基化和TGS45

3.2RdDM和同源依赖性基因沉默45

3.4植物胞核存在一个独立的dsRNA加工途径吗？46

3.5细胞质产生RdDM的RNA信号46

3.6可移动沉默信号和DNA甲基化47

3.7RdDM的机制47

3.7.1RdDM：短RNA或dsRNA？48

3.7.2DNA甲基转移酶和RdDM50

3.7.3染色质因子和RdDM51

3.7.4遗传筛选发现新的RdDM缺陷突变型52

3.8RdDM只在植物中发生吗？53

3.9蛋白编码区和启动子甲基化的不同后果54

3.10RNA介导的染色质修饰？55

3.11脉孢菌中不配对DNA引起的减数分裂沉默56

3.12启动子dsRNA的天然来源56

3.13类病毒致病性：宿主基因的RdDM？57

3.14RNA介导TGS在功能基因组学中的应用57

3.14.1启动子反向重复序列的长度和组成58

3.14.4多聚腺苷酸化信号59

3.14.3转录启动子59

3.14.2间隔区大小和序列59

3.15RNA介导的基因组修饰60

致谢60

参考文献60

4线虫中的RNAi（孟庆文译仇华吉校）65

4.1概念与策略66

4.1.1RNAi缺陷型突变体66

4.1.2RNAi机制68

4.1.4转移性RNAi和免疫系统70

4.1.3RNAi的遗传性70

4.1.5RNAi的传播72

4.1.6共抑制和RNAi73

4.1.7转座子沉默、共抑制和RNAi之间的关系：三种现象，一种机制？74

4.1.8RNAi的天然功能74

4.2实验技术76

实验方案1：dsRNA导入77

实验方案2：共抑制79

实验方案3：RNA分离79

实验方案4：si/miRNA检测80

参考文献82

致谢82

5RNA与生物学：RNAi生物化学研究（师迎旭译岳培斌校）86

5.1RNAi的生物化学86

5.2通过体内研究了解RNAi机制87

5.3RNAi研究的生化模型87

5.4RISC:RNAi的催化动力（engine）89

5.5通过Dicer作用产生siRNA92

5.6Dicer和miRNA的发现94

5.8哺乳动物细胞RNAi的生物化学97

5.7体内的Dicer97

5.9主旋律中的变调？98

5.10RNAi与人类疾病的关联？101

5.11RNAi与基因组103

5.12总结104

参考文献105

6shRNA介导哺乳动物基因表达沉默（张卓远译郑晓飞校）110

6.1调节基因表达的RNA发夹结构110

6.2siRNA111

6.3两种RNA沉默通路的联系113

6.4RNA沉默分子的结构114

6.5miRNA作用靶点115

6.6介导基因沉默的发夹RNA遗传操作115

6.7shRNA介导动物基因表达沉默120

6.8RNAi稳定转基因动物121

6.9结论122

致谢124

参考文献124

7转座元件、RNAi与异染色质起源（郭永译章金刚校）129

7.1转座子作为控制元件130

7.2异染色质和转座子图谱131

7.3转座子沉默机制134

7.3.1DNA甲基化134

7.3.2组蛋白修饰135

7.3.3染色质重建（remodeling）136

7.3.4RNA干扰138

7.4RNAi和转录沉默在机制上是相关的139

7.4.1裂殖酵母中的转座子、重复序列和基因沉默139

7.4.2RNAi和着丝粒沉默140

7.4.3染色质连接141

7.4.4建立还是维持？142

7.4.5着丝粒功能143

7.5结论144

参考文献144

8核糖核酸酶Ⅲ超家族：在RNA成熟、降解与基因沉默中的结构150

与功能（梅柱中译陈忠斌孙志贤校）150

8.1RNaseⅢ超家族概述151

8.1.1细菌RNaseⅢ功能152

8.1.3细菌RNaseⅢ同源分子的底物反应表位154

8.1.2其他细菌RNaseⅢ同源分子的功能154

8.2细菌RNaseⅢ作用机制156

8.2.1催化结构域：功能与结构特点156

8.2.2dsRBM：结构与功能特点158

8.2.3活性位点结构与参与的二价金属离子159

8.2.4细菌RNaseⅢ作用机制总结161

8.2.5酵母RNaseⅢ同源分子：底物与功能162

8.2.6高等真核生物RNaseⅢ同源分子结构与功能165

8.3Dicer在RNAi和调节性小RNA成熟中的结构与功能166

8.3.3Dicer作用机制与结构167

8.3.1Dicer产生siRNA167

8.3.2Dicer参与调节性小RNA的成熟加工167

8.4关于RNaseⅢ起源169

8.5总结与展望170

致谢170

参考文献170

9RNA依赖的RNA聚合酶在基因沉默中的作用（周绪斌译陈忠斌校）176

9.1概念与策略178

9.1.1番茄细胞RdRP178

9.1.2RdRP同源基因在基因沉默中的作用181

9.1.3降解性PCR（degradativePCR）与转移性RNAi（transitiveRNAi）184

9.1.4基因沉默作用模型189

9.1.5细胞和病毒RdRP是否有进化上的关系？190

9.2QDE-1的RdRP活性193

9.3总结194

9.4实验技术194

实验方案1：RdRP活性测定194

实验方案2：短合成模板的转录195

实验方案3：果蝇胚胎提取物的制备及分级分离197

实验方案4：从果蝇胚胎提取物制备siRNA198

实验方案5：siRNA引导的RNA合成199

致谢201

参考文献201

10异染色质结构与功能：表遗传性基因沉默与基因组组织结构的联系（陈留存李洁刘朝晖译邵宁生校）206

10.1异染色质特性207

10.1.1凝聚207

10.1.2转录抑制208

10.1.3重组抑制208

10.1.4染色体分离209

10.1.5序列组成211

10.2位置效应色斑的调节物211

10.2.1异染色质蛋白1211

10.2.2组蛋白和组蛋白修饰212

10.3常染色质表遗传控制中的异染色质样结构214

10.3.1HP1控制“常染色质”214

10.3.2发育中可遗传的基因抑制214

10.3.4新着丝粒215

10.4异染色质的起始机制215

10.3.3表等位基因215

10.4.1DNA结合蛋白216

10.4.2重复序列诱导的异染色质形成216

10.4.3RNA指导的沉默217

10.5事例研究：裂殖酵母异染色质形成217

10.5.1着丝粒与端粒218

10.5.2沉默mat位点的异染色质调节基因沉默、重组和交配型转换218

10.5.3异染色质形成中的着丝粒重复序列219

10.5.4RNAi与粟酒裂殖酵母异染色质组装220

10.5.6异染色质结构域的建立和维持221

10.5.5异染色质边界221

10.6结论224

致谢224

参考文献225

11高通量RNAi：线虫全基因组RNAi筛选（孟庆文译仇华吉校）234

11.1概念与策略235

11.1.1将dsRNA导入线虫的方法235

11.1.2RNAi作为分析大批基因功能的工具236

11.1.3RNAi与正向遗传学的局限性与差异238

11.1.4RNAi筛选设计注意事项239

11.3结语241

致谢241

11.2RNAi筛选的前景241

参考文献242

12PTGS技术与植物大规模功能基因组学研究（毛建平译陈忠斌校）244

12.1概念与策略244

12.1.1正向遗传学244

12.1.2反向遗传学245

12.1.3PTGS系统246

稳定转化法递送双链DNA259

12.2实验技术259

粒子轰击法递送双链RNA259

农杆菌渗入法递送双链RNA260

通过VIGS方法递送dsRNA261

12.3展望262

致谢262

参考文献263

13哺乳动物中的RNAi（杨明译付汉江郑晓飞校）266

13.1.1RNA干扰的一般机制267

13.1概念与策略267

13.1.2应用RNAi分析哺乳动物细胞基因功能274

13.2小结281

13.3实验技术282

实验方案1：siRNA序列的选择282

实验方案2：siRNA退火制备siRNA双链体283

实验方案3：细胞培养及24孔板细胞制备284

实验方案4：荧光素酶报告质粒与siRNA双链体共转染285

实验方案5：siRNA双链体转染287

实验方案6：蛋白质敲减的免疫荧光实验288

实验方案7：Western印迹检测蛋白质敲减289

致谢291

参考文献291

14禽类胚胎中的RNAi（周绪斌译陈忠斌校）298

14.1鸡胚作为研究神经系统发育过程中基因功能的模型299

14.1.1注射和电穿孔dsRNA引起靶基因特异性表达下调301

14.1.2卵中RNAi引起的基因沉默导致特异性功能缺失表型301

14.2实验技术303

实验方案1：dsRNA制备303

14.1.3卵中RNAi的应用303

实验方案2：dsRNA向卵内注射及电穿孔305

实验方案3：轴突寻路分析307

致谢311

参考文献312

15小鼠卵母细胞和植入前胚胎细胞中的RNAi（詹林盛译王全立校）314

15.1概念与策略314

15.1.1哺乳动物细胞对dsRNA的反应314

15.1.2哺乳动物RNAi途径315

15.1.3RNAi在哺乳动物早期胚胎细胞中的作用317

15.1.4RNAi作为研究哺乳动物的实验手段319

15.2发展方向324

15.3实验技术325

实验方案1：长dsRNA分子的制备325

实验方案2：显微注射卵母细胞和早期胚胎细胞332

致谢340

参考文献341

16果蝇细胞培养中的RNAi技术（饶林译王全立校）345

16.1.1果蝇S2细胞系统的特性346

16.1概念与策略346

16.1.2RNAi在S2细胞培养中的应用348

16.2实验技术349

16.2.1S2细胞RNAi实验方案349

16.2.2dsRNA的制备350

16.2.3其他注意事项351

16.2.4关于靶序列的更多说明352

16.2.5S2细胞RNAi的应用353

16.3结语356

参考文献357

注释357

致谢357

17RNAi技术在果蝇中的应用（仇华吉译温亚丽陈忠斌校）360

17.1概念与策略361

17.1.1外源性RNAi361

17.1.2内源性RNAi363

17.1.3外源性和内源性RNAi方法的选择365

17.1.4RNAi特异性的确定366

17.2实验技术367

实验方案1：dsRNA合成368

实验方案2：胚胎显微注射和分析372

实验方案3：用基因枪将dsRNA送入胚胎377

实验方案4：胚胎表型分析381

实验方案5：细胞培养RNAi388

实验方案6：原代细胞RNAi390

实验方案7：第一代转基因RNAi390

实验方案8：第二代转基因RNAi392

致谢395

参考文献396

18布氏锥虫及其他非经典模式生物RNAi（杨光曹国军译邵宁生校）398

18.1RNAi是研究进化多样性的工具398

18.1.1草履虫398

18.1.2水螅399

18.1.3Cupiennius蜘蛛399

18.1.4盘基网柄菌399

18.2锥虫RNAi的一般特点400

18.2.1布氏锥虫RNAi研究的早期历史400

18.2.2布氏锥虫中可诱导和可遗传的RNAi方法400

18.2.3引发RNAi的双链RNA特点401

18.2.5RNAi利用于功能研究402

18.3siRNA特征402

18.2.4RNAi能迅速引起胞浆内mRNA降解402

18.3.1外源dsRNA产生的siRNA分析403

18.3.2内源转录体产生的siRNA分析：RNAi在沉默反转录转座子转录物中的作用403

18.4mRNA翻译在RNAi机制中的作用404

18.4.1siRNA与多聚核糖体相互作用404

18.4.2RNAi与mRNA翻译的偶联：一种模型405

18.4.3翻译依赖和非翻译依赖RNAi机制405

18.5.2Argonaute家族基因是锥虫RNAi必需的406

18.5锥虫中RNAi的遗传学分析406

18.5.1RNAi对生存是非必需的406

18.6总结407

致谢407

参考文献407

附录1 （孟庆文译仇华吉校）409

附录2 陈忠斌温亚丽译）416

中西文对照417

索引422